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Despite the effectiveness of combined antiretroviral therapy (cART), people living with HIV (PLWH) still experience high rates of morbidity and mortality compared with uninfected people. These persisting health issues stem from various factors, including opportunistic infections that can develop as a result of the disruption of the intestinal epithelial barrier. In fact, HIV-1 replication in the gastrointestinal tract leads to significant depletion of CD4+ T cells and infection of macrophages that act as reservoirs for the virus. Immune cells dysfunction contributes to the alteration of the intestinal barrier allowing for translocation of microbial products and pathogens from the gut lumen into the bloodstream, triggering systemic immune activation and inflammation, both common features of chronic HIV-infection. This chronic inflammation and microbial translocation can fuel further HIV replication and immune dysfunction, perpetuating a cycle of mucosal damage and immune activation that can lead to a range of gastrointestinal complications (i.e. leaky gut syndrome and impaired nutrient absorption). It is therefore necessary to identify new early methods of detecting intestinal mucosal damage that occurs during HIV infection. Gut biopsy procedures, considered the gold standard for studying the intestinal barrier, are invasive and impractical for large populations. So, there is a need for more practical and less invasive alternative procedures. This study aimed to study the correlation between the expression of structural and immunological genes and protein at the gastrointestinal level and the presence of plasma markers that may be indicative of intestinal damage in PLWH undergoing cART and to evaluate the differences between both subjects with different clinical stage and subjects with different treatment regimen. To this end, colon mucosal biopsies and plasma from a cohort of PLWH on different triple drug regimens were analyzed. Gene expression of 14 structural genes (TJP1, TJP2, TJP3, OCLN, CLDN1, CLDN2, CLDN3, CLDN4, CLDN7, CLDN15, MMP3, MMP9, F11R, MYLK) and 14 immuno-related genes (MAPK3, STAT3, STAT6, TGF-β1, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-13, IL-17A, IL-22, TNF-α, SLPI, β-DEF1, β-DEF2) in biopsies was first analyzed by RT-PCR. Also, protein expression of TJP1, MMP3 and JAM-A (F11R) was assessed. Plasma biomarkers of intestinal damage (I-FABP, zonulin, OCLN, E-cadherin, REG3α, and TFF3) along with biomarkers of microbial translocation and systemic inflammation (lipopolysaccharide (LPS), lipopolysaccharide-binding protein (LBP), soluble CD14 (sCD14), and interleukin (IL)-6) were, on the other hand, measured by ELISA assay. Finally, Spearman's correlation analysis was performed between gene expression data and the presence of plasma markers. The analysis showed that: (i) plasma OCLN levels positively correlated with gene expression of CLDN4, β-DEF2, IL-17A, and STAT3 and with detection of I-FABP, E-cad, TFF3, and IL-6 in plasma; (ii) detection of E-cad in plasma correlates positively with the gene expression of CLDN4, IL-17A, STAT3, and STAT6 and with the levels of OCLN in plasma; and (iii) the presence of IL-6 in plasma correlates negatively with the expression of CLDN3, CLDN15, F11R, OCLN, TJP1, and TJP2 while it correlates positively with the plasma detection of OCLN and TFF3. Moreover, a 1.9% proportional increase in the frequency of OCLN detection was found for each 1% increase in E-cad detection. Our data suggest that simultaneous detection of OCLN, E-cad and IL-6 in plasma could be employed to have an indirect assessment of intestinal barrier function. Overall, these findings may contribute to the development of non-invasive diagnostic strategies to assess intestinal epithelial damage in PLWH and ultimately serve as risk markers for the development of non-AIDS-related comorbidities.

Nonostante l’efficacia della terapia antiretrovirale combinata (cART), le persone infette da HIV (PLWH), presentano ancora alti tassi di morbidità e mortalità rispetto alle persone non infette. Questi problemi di salute persistenti derivano da vari fattori. La replicazione di HIV-1 nel tratto gastrointestinale porta ad una significativa deplezione delle cellule T CD4+ ed all’infezione di macrofagi che fungono da serbatoio per il virus. La disfunzione delle cellule immunitarie contribuisce al danneggiamento della barriera intestinale, consentendo la traslocazione di prodotti microbici e patogeni dal lume intestinale al flusso sanguigno, innescando un'attivazione immunitaria sistemica e un'infiammazione. L’infiammazione cronica e la traslocazione microbica possono alimentare ulteriormente la replicazione di HIV e la disfunzione immunitaria, perpetuando un ciclo di danno alla mucosa e di attivazione immunitaria che può portare ad una serie di complicazioni intestinali. È quindi necessario individuare nuovi metodi per rilevare precocemente il danno alla mucosa intestale che si verifica durante l’infezione da HIV. La procedura d’elezione per lo studio della barriera intestinale è la biopsia intestinale, ma è ovviamente una procedura molto invasiva e poco praticabile per popolazioni numerose. Per cui è necessario disporre di un’alterativa più pratica e meno invasiva, come la ricerca di marcatori plasmatici che possano correlare con il danno alla barriera intestinale e alla traslocazione microbica. Questo studio ha l'obiettivo di identificare le correlazioni tra l’espressione di geni e proteine, strutturali e immunologici, a livello gastrointestinale e la presenza di marcatori plasmatici che possono essere indicativi del danno intestinale in PLWH sottoposte cART e valutare le differenze tra soggetti sia in uno stato clinico differente o che assumono un diverso regime terapeutico. A tal fine sono state analizzate biopsie della mucosa del colon e il plasma di una coorte di PLWH in trattamento con diversi regimi farmacologici a tre farmaci. L’espressione genica di 14 geni strutturali (TJP1, TJP2, TJP3, OCLN, CLDN1, CLDN2, CLDN3, CLDN4, CLDN7, CLDN15, MMP3, MMP9, F11R, MYLK) e 14 geni immuno-correlati (MAPK3, STAT3, STAT6, TGF-β1, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-13, IL-17A, IL-22, TNF-α, SLPI, β-DEF1, β-DEF2) nelle biopsie, sono stati analizzati mediante l’utilizzo di RT-PCR. È stata inoltre valutata l'espressione proteica di TJP1, MMP3 e JAM-A (F11R). I biomarcatori plasmatici del danno intestinale (I-FABP, zonulina, OCLN, E-caderina, REG3α e TFF3) ed i biomarcatori della traslocazione microbica e dell'infiammazione sistemica (lipopolisaccaride (LPS), proteina legante il lipopolisaccaride (LBP), CD14 solubile (sCD14) e interleuchina (IL)-6) sono stati misurati con un test ELISA. Infine, è stata eseguita l'analisi di correlazione di Spearman tra i dati di espressione genica e i marcatori plasmatici. I nostri dati evidenziano che: (i) i livelli plasmatici di OCLN correlano positivamente con l'espressione genica di CLDN4, β-DEF2, IL-17A e STAT3 e con la presenza di I-FABP, E-cad, TFF3 e IL-6 nel plasma; (ii) la presenza di E-cad nel plasma correla positivamente con l'espressione genica di CLDN4, IL-17A, STAT3 e STAT6 e con i livelli di OCLN nel plasma; e (iii) la presenza di IL-6 nel plasma correla negativamente con l'espressione di CLDN3, CLDN15, F11R, OCLN, TJP1 e TJP2, mentre correla positivamente con la rilevazione plasmatica di OCLN e TFF3 I nostri dati suggeriscono che la rilevazione simultanea di OCLN, E-cad e IL-6 nel plasma potrebbe essere utilizzata per valutare indirettamente la funzione della barriera intestinale. Questi risultati possono contribuire allo sviluppo di strategie diagnostiche non invasive per valutare il danno epiteliale intestinale nelle PLWH ed essere utili marcatori di rischio per lo sviluppo di comorbidità non correlate ad AIDS.

Marcatori Plasmatici della Disfunzione della Mucosa Gastrointestinale in Soggetti Affetti da Infezione da HIV-1 (PLWH) in Terapia Antiretrovirale combinata (cART).

ZAMARATO, ROBERTA
2022/2023

Abstract

Despite the effectiveness of combined antiretroviral therapy (cART), people living with HIV (PLWH) still experience high rates of morbidity and mortality compared with uninfected people. These persisting health issues stem from various factors, including opportunistic infections that can develop as a result of the disruption of the intestinal epithelial barrier. In fact, HIV-1 replication in the gastrointestinal tract leads to significant depletion of CD4+ T cells and infection of macrophages that act as reservoirs for the virus. Immune cells dysfunction contributes to the alteration of the intestinal barrier allowing for translocation of microbial products and pathogens from the gut lumen into the bloodstream, triggering systemic immune activation and inflammation, both common features of chronic HIV-infection. This chronic inflammation and microbial translocation can fuel further HIV replication and immune dysfunction, perpetuating a cycle of mucosal damage and immune activation that can lead to a range of gastrointestinal complications (i.e. leaky gut syndrome and impaired nutrient absorption). It is therefore necessary to identify new early methods of detecting intestinal mucosal damage that occurs during HIV infection. Gut biopsy procedures, considered the gold standard for studying the intestinal barrier, are invasive and impractical for large populations. So, there is a need for more practical and less invasive alternative procedures. This study aimed to study the correlation between the expression of structural and immunological genes and protein at the gastrointestinal level and the presence of plasma markers that may be indicative of intestinal damage in PLWH undergoing cART and to evaluate the differences between both subjects with different clinical stage and subjects with different treatment regimen. To this end, colon mucosal biopsies and plasma from a cohort of PLWH on different triple drug regimens were analyzed. Gene expression of 14 structural genes (TJP1, TJP2, TJP3, OCLN, CLDN1, CLDN2, CLDN3, CLDN4, CLDN7, CLDN15, MMP3, MMP9, F11R, MYLK) and 14 immuno-related genes (MAPK3, STAT3, STAT6, TGF-β1, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-13, IL-17A, IL-22, TNF-α, SLPI, β-DEF1, β-DEF2) in biopsies was first analyzed by RT-PCR. Also, protein expression of TJP1, MMP3 and JAM-A (F11R) was assessed. Plasma biomarkers of intestinal damage (I-FABP, zonulin, OCLN, E-cadherin, REG3α, and TFF3) along with biomarkers of microbial translocation and systemic inflammation (lipopolysaccharide (LPS), lipopolysaccharide-binding protein (LBP), soluble CD14 (sCD14), and interleukin (IL)-6) were, on the other hand, measured by ELISA assay. Finally, Spearman's correlation analysis was performed between gene expression data and the presence of plasma markers. The analysis showed that: (i) plasma OCLN levels positively correlated with gene expression of CLDN4, β-DEF2, IL-17A, and STAT3 and with detection of I-FABP, E-cad, TFF3, and IL-6 in plasma; (ii) detection of E-cad in plasma correlates positively with the gene expression of CLDN4, IL-17A, STAT3, and STAT6 and with the levels of OCLN in plasma; and (iii) the presence of IL-6 in plasma correlates negatively with the expression of CLDN3, CLDN15, F11R, OCLN, TJP1, and TJP2 while it correlates positively with the plasma detection of OCLN and TFF3. Moreover, a 1.9% proportional increase in the frequency of OCLN detection was found for each 1% increase in E-cad detection. Our data suggest that simultaneous detection of OCLN, E-cad and IL-6 in plasma could be employed to have an indirect assessment of intestinal barrier function. Overall, these findings may contribute to the development of non-invasive diagnostic strategies to assess intestinal epithelial damage in PLWH and ultimately serve as risk markers for the development of non-AIDS-related comorbidities.
DIPARTIMENTO DI MEDICINA MOLECOLARE
2022
Plasma Markers of Gastrointestinal Mucosal Barrier Dysfunction in People Living with HIV (PLWH) receiving combined Antiretroviral Therapy (cART)
Nonostante l’efficacia della terapia antiretrovirale combinata (cART), le persone infette da HIV (PLWH), presentano ancora alti tassi di morbidità e mortalità rispetto alle persone non infette. Questi problemi di salute persistenti derivano da vari fattori. La replicazione di HIV-1 nel tratto gastrointestinale porta ad una significativa deplezione delle cellule T CD4+ ed all’infezione di macrofagi che fungono da serbatoio per il virus. La disfunzione delle cellule immunitarie contribuisce al danneggiamento della barriera intestinale, consentendo la traslocazione di prodotti microbici e patogeni dal lume intestinale al flusso sanguigno, innescando un'attivazione immunitaria sistemica e un'infiammazione. L’infiammazione cronica e la traslocazione microbica possono alimentare ulteriormente la replicazione di HIV e la disfunzione immunitaria, perpetuando un ciclo di danno alla mucosa e di attivazione immunitaria che può portare ad una serie di complicazioni intestinali. È quindi necessario individuare nuovi metodi per rilevare precocemente il danno alla mucosa intestale che si verifica durante l’infezione da HIV. La procedura d’elezione per lo studio della barriera intestinale è la biopsia intestinale, ma è ovviamente una procedura molto invasiva e poco praticabile per popolazioni numerose. Per cui è necessario disporre di un’alterativa più pratica e meno invasiva, come la ricerca di marcatori plasmatici che possano correlare con il danno alla barriera intestinale e alla traslocazione microbica. Questo studio ha l'obiettivo di identificare le correlazioni tra l’espressione di geni e proteine, strutturali e immunologici, a livello gastrointestinale e la presenza di marcatori plasmatici che possono essere indicativi del danno intestinale in PLWH sottoposte cART e valutare le differenze tra soggetti sia in uno stato clinico differente o che assumono un diverso regime terapeutico. A tal fine sono state analizzate biopsie della mucosa del colon e il plasma di una coorte di PLWH in trattamento con diversi regimi farmacologici a tre farmaci. L’espressione genica di 14 geni strutturali (TJP1, TJP2, TJP3, OCLN, CLDN1, CLDN2, CLDN3, CLDN4, CLDN7, CLDN15, MMP3, MMP9, F11R, MYLK) e 14 geni immuno-correlati (MAPK3, STAT3, STAT6, TGF-β1, IFN-γ, IL-1β, IL-6, IL-13, IL-17A, IL-22, TNF-α, SLPI, β-DEF1, β-DEF2) nelle biopsie, sono stati analizzati mediante l’utilizzo di RT-PCR. È stata inoltre valutata l'espressione proteica di TJP1, MMP3 e JAM-A (F11R). I biomarcatori plasmatici del danno intestinale (I-FABP, zonulina, OCLN, E-caderina, REG3α e TFF3) ed i biomarcatori della traslocazione microbica e dell'infiammazione sistemica (lipopolisaccaride (LPS), proteina legante il lipopolisaccaride (LBP), CD14 solubile (sCD14) e interleuchina (IL)-6) sono stati misurati con un test ELISA. Infine, è stata eseguita l'analisi di correlazione di Spearman tra i dati di espressione genica e i marcatori plasmatici. I nostri dati evidenziano che: (i) i livelli plasmatici di OCLN correlano positivamente con l'espressione genica di CLDN4, β-DEF2, IL-17A e STAT3 e con la presenza di I-FABP, E-cad, TFF3 e IL-6 nel plasma; (ii) la presenza di E-cad nel plasma correla positivamente con l'espressione genica di CLDN4, IL-17A, STAT3 e STAT6 e con i livelli di OCLN nel plasma; e (iii) la presenza di IL-6 nel plasma correla negativamente con l'espressione di CLDN3, CLDN15, F11R, OCLN, TJP1 e TJP2, mentre correla positivamente con la rilevazione plasmatica di OCLN e TFF3 I nostri dati suggeriscono che la rilevazione simultanea di OCLN, E-cad e IL-6 nel plasma potrebbe essere utilizzata per valutare indirettamente la funzione della barriera intestinale. Questi risultati possono contribuire allo sviluppo di strategie diagnostiche non invasive per valutare il danno epiteliale intestinale nelle PLWH ed essere utili marcatori di rischio per lo sviluppo di comorbidità non correlate ad AIDS.
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