Studio di visualizzazione del misfolding co-traduzionale dell'alfa-1-antitripsina sul ribosoma

This thesis examines the protein folding and misfolding mechanism of Alpha-1-Antitrypsin (AAT). Folding is the process through which proteins attain their functional three-dimensional structure. Misfolding occurs when proteins fail to reach or maintain their correct structure, leading to functional impairment and potential toxicity, thus causing various pathological conditions. Ribosomes control the rate of translation and the time that the nascent chain has to explore various conformations. The structure of the nascent chain attached to the ribosome during its biosynthesis is called a ribosome nascent chain (RNC). Proteins (normally <50 aa) may either be released in their linear form and fold in the endoplasmic reticulum, or start folding while emerging from the ribosomal exit tunnel, a process known as co-translational folding. In this case, if the nascent chain is mutated, it stalls for a longer time on the ribosome, and it is more prone to misfolding. Misfolding can lead to aggregation, e.g. via recruitment of partially folded released nascent chains to the RNC. This misfolding theory is called “co-post misassembly”. In this work, the focus is on AAT, a glycoprotein acting as a protease inhibitor whose role is to inhibit the proteolytic enzyme elastase, thus protecting organs such as lungs and liver. Mutations in the SERPINA1 gene results in a range of different diseases, with the Z-mutant allele (E342K) causing one of the most dangerous phenotypes when in homozygosis. Z AAT is particularly prone to misfolding, leading to aggregation and lack of AAT release in the blood circulation, and consequent loss of function. There is a need to understand the mechanism behind the misfolding process of AAT, especially during translation on the ribosome. Understanding these mechanisms could provide insights into diseases associated with AAT deficiency and aid in the development of therapeutic strategies. To reach this target, this work aimed to develop a protocol for visualisation of AAT RNC using streptavidin-golden beads. The streptavidin is known to efficiently bind biotin which was used as a molecular bridge between the golden beads and the avi-tagged AAT RNCs. These studies were conducted via anti-avi western blots which allowed testing and protocol optimisation for AAT RNC complex formation, biotinylation and streptavidin efficient binding. For the latter, biotinylated avi-tagged YFP (Yellow Fluorescent Protein) was used as a control to optimize biotin concentration. Streptavidin binding was confirmed indirectly on western blots through the analysis of the AAT RNC band colour intensity. An intensity decrease was considered as a confirmation that less AAT RNC were left unbound to streptavidin. This indirect approach was chosen since the streptavidin-biotin-avi-AAT RNC was not visible on the western blot, due to the avi-tag occultation caused by the large size of streptavidin. Subsequent experiments focused on avi-tagged AAT expression and purification to be used as a trigger (“seed”) for the seeded reaction that aimed to prove the co-translational misassembly. Despite challenges in minimizing background noise, it was possible to validate this theory in our western blot experiments by observing the fainting of both the AAT and AAT RNC bands, with the simultaneous intensity increase of the band that represent their binding. In summary, the research highlights the complexity of AAT misfolding, outlines methodology optimizations, provides insights into polymerization mechanisms, and suggests avenues for future investigations to deepen understanding in this field. Future Work will be about reducing western blots background and further exploring new conditions for the seeded reaction, such as combining wild type AAT RNC with Z AAT or viceversa to more deeply analyse how the polymerisation is affected by the mutation.

Questa tesi esamina il meccanismo di folding e misfolding della proteina dell'Alpha-1-Antitripsina (AAT). Il folding è il processo attraverso il quale le proteine raggiungono la loro struttura tridimensionale funzionale. Il misfolding si verifica quando le proteine non riescono a raggiungere o mantenere la loro corretta struttura, portando a un deterioramento funzionale e potenziale tossicità, causando così varie condizioni patologiche. I ribosomi controllano il tasso di traduzione e il tempo che la catena nascente ha per esplorare varie conformazioni. La struttura della catena nascente attaccata al ribosoma durante la sua biosintesi è chiamata ribosome nascent chain (RNC). Le proteine possono essere rilasciate in forma lineare e piegarsi nel reticolo endoplasmatico, oppure iniziare a piegarsi mentre emergono dal tunnel di uscita ribosomiale (co-translational folding). In questo caso, se la catena nascente è mutata, si blocca più a lungo sul ribosoma, ed è più incline al misfolding. Il misfolding può portare all’aggregazione, ad esempio tramite il reclutamento di catene nascenti libere parzialmente piegate all’RNC. Questa teoria del misfolding è chiamata “co-post misassembly”. In questo lavoro, l’attenzione è rivolta all'AAT, una glicoproteina inibisce l'enzima proteolitico elastasi, proteggendo così organi come polmoni e fegato. Mutazioni nel gene SERPINA1 risultano in una gamma di diverse malattie, con l’allele mutante Z (E342K) che causa uno dei fenotipi più pericolosi quando in omozigosi. Z AAT è particolarmente incline al misfolding, portando all'aggregazione e al mancato rilascio di AAT in circolo, e conseguente perdita di funzione. È necessario comprendere il meccanismo dietro il processo di misfolding dell’AAT, specialmente durante la traduzione sul ribosoma. Comprendere questi meccanismi potrebbe fornire spunti sulle malattie associate alla carenza di AAT e aiutare nello sviluppo di strategie terapeutiche. Questo lavoro ha mirato a sviluppare un protocollo per la visualizzazione dell’AAT RNC utilizzando particelle d’oro legate alla streptavidina. La streptavidina è nota per legarsi efficientemente alla biotina che è stata utilizzata come ponte molecolare tra le particelle d’oro e gli AAT RNC ingegnerizzati con avi-tag. Questi studi sono stati condotti tramite western blotting anti-avi che hanno permesso di testare e ottimizzare il protocollo per la formazione del complesso AAT RNC, della biotinilazione, e dell’efficiente legame della streptavidina. Il legame della streptavidina è stato confermato indirettamente sui western blot attraverso l’analisi dell’intensità del colore della banda AAT RNC. Una diminuzione dell’intensità è stata considerata come una conferma che meno AAT RNC sono rimasti non legati alla streptavidina. Questo approccio indiretto è stato scelto poiché il complesso (streptavidina-biotina-avi-AAT RNC) non era visibile sul western blot a causa dell’occultamento dell’avi-tag causato dalle grandi dimensioni della streptavidina. Gli esperimenti successivi si sono concentrati sull’espressione e purificazione dell’AAT marcata con avi da utilizzare come innesco (“seed”) per la seeded reaction che mirava a dimostrare il co-translational misassembly. E’ stato possibile validare questa teoria tramite western blot osservando la diminuzione sia delle bande dell’AAT che delle bande AAT RNC, con l'aumento simultaneo dell’intensità della banda da rappresentante il loro legame. In sintesi, la ricerca evidenzia la complessità del misfolding di AAT, delinea le ottimizzazioni metodologiche, fornisce spunti sui meccanismi di polimerizzazione. I lavori futuri riguarderanno la riduzione del background dei western blot e l’esplorazione di nuove condizioni per la seeded reaction, come la combinazione di RNC wild type con Z AAT o viceversa per analizzare più a fondo come la polimerizzazione è influenzata dalla mutazione.