Esame della deformabilità del cluster di tumore al seno e ottimizzazione del dispositivo di cattura delle cellule tumorali circolanti

ABSTRACT: Metastasis is a multi-step process often mediated by circulating tumor cells (CTCs). CTCs are found in blood as single cells and clusters composed on 2-50 cells. CTCs are very rare in circulation. In 1 ml of blood, CTCs represent 10-100 cells in a background of millions of white blood cells and billions of red blood cells.[1] Profiling CTCs might help to better understand the metastatic cascade and provide criterial for treatment decision making. However, because of their rarity, their isolation requires significant technical efforts. We wanted to examine the effect of mechanical stress on breast tumor clusters, and to address this question we introduced human breast cancer clusters through narrow constrictions in a microfluidic chip. This device allows us mimic the mechanical deformation that tumor collectives can go through in vivo. Cells can experience large solid stresses (1-7kPa) within a growing tumour, which can induce deformation, mechanical alterations and enhance migration of cells away from the tumour.[2] Mechanical alterations, such as changes in stiffness and morphology, play a significant role in all stages of cancer initiation and dissemination.[3] Further experiments showed that this mechanical deformation influence the pathophysiological and biological properties of the cells (gene expression, viscosity of the clusters, cluster cohesiveness, which eventually could lead to increasing of aggressiveness of the cancer. Using a 3D collagen invasion assay, we demonstrated a correlation between cluster cohesiveness and collective invasion behavior in vitro which may be linked to specific behavior of invading groups of cells in vivo. Using a separate microfluidic system (the Pillar7 device), we captured single CTC and CTC clusters from whole blood according to size and deformability. The main purpose of the device is to capture, enumerate and characterize CTCs from patients with hormone receptor-positive HER2-negative advanced breast cancer. We validated the device using MDA-MB-231 and MCF7 cells specifically showed that MCF7 cells/ clusters were captured with high efficiency. In summary, we have developed and applied two micro-fluidic systems. The first applied rapid compression forces onto tumor spheroids, while the second system profiled CTCs and clusters based on size and deformability. These systems have the potential to be applied towards diagnostic purposes, to predict response to therapy for various types of cancer.

RIASSUNTO La metastasi è un processo in più fasi spesso mediato dalle cellule tumorali circolanti (CTC). Le CTC si trovano nel sangue come singole cellule e cluster composti da 2-50 cellule. Le CTC sono molto rare in circolazione. In 1 ml di sangue, le CTC rappresentano 10-100 cellule su un contesto di milioni di globuli bianchi e miliardi di globuli rossi [1]. La profilazione delle CTC potrebbe aiutare a comprendere meglio la cascata metastatica e fornire criteri per il processo decisionale sul trattamento. Tuttavia, a causa della loro rarità, il loro isolamento richiede notevoli sforzi tecnici. In questo lavoro di tesi volevamo esaminare l'effetto dello stress meccanico sui cluster di tumori al seno e per rispondere a questa domanda abbiamo introdotto cluster di tumori al seno umani attraverso costrizioni strettamente controllate in un chip microfluidico. Questo dispositivo ci consente di imitare la deformazione meccanica che i complessi tumorali possono subire in vivo. Le cellule possono subire grandi stress solidi (1-7 kPa) all'interno di un tumore in crescita, che possono indurre deformazioni, alterazioni meccaniche e aumentare la migrazione delle cellule lontano dal tumore [2]. Le alterazioni meccaniche, come i cambiamenti nella rigidità e nella morfologia, svolgono un ruolo significativo in tutte le fasi dell'inizio e della diffusione del cancro [3]. Ulteriori esperimenti hanno dimostrato che questa deformazione meccanica influenza le proprietà fisiopatologiche e biologiche delle cellule (espressione genica, viscosità dei cluster, coesione dei cluster, che alla fine potrebbe portare ad un aumento dell'aggressività del cancro. Utilizzando un test di invasione del collagene 3D, abbiamo dimostrato unacorrelazione tra coesione del cluster e comportamento di invasione collettiva in vitro che può essere collegata al comportamento specifico di gruppi di cellule invasive in vivo. Utilizzando un sistema microfluidico separato (il dispositivo Pillar7), abbiamo catturato singole CTC e cluster di CTC dal sangue intero in base alle dimensioni e alla deformabilità. Lo scopo principale del dispositivo è acquisire, enumerare e caratterizzare le CTC di pazienti con carcinoma mammario avanzato HER2-negativo con recettori ormonali positivi. Abbiamo convalidato il dispositivo utilizzando le cellule MDA-MB-231 e MCF7, in particolare abbiamo dimostrato che le cellule/cluster MCF7 venivano catturate con alta efficienza. In sintesi, abbiamo sviluppato e applicato due sistemi microfluidici. Il primo ha applicato forze di compressione rapide sugli sferoidi tumorali, mentre il secondo sistema ha profilato CTC e cluster in base alle dimensioni e alla deformabilità. Questi sistemi hanno il potenziale per essere applicati a scopi diagnostici, per prevedere la risposta alla terapia per vari tipi di cancro.