Sviluppo di dispositivi basati su biosensori microbici per il rilevamento di nitrati, fosfati e acidi organici in campioni di interesse agroindustriale.

The advancements achieved in Synthetic Biology, together with 3D Bioprinting techniques, form the foundations that are revolutionizing the biomedical field and the scientific domain as a whole. Synthetic Biology focuses on designing and engineering biological systems with specific characteristics, employing engineering approaches and advanced DNA manipulation technologies aimed at implementing new functionalities or creating novel biological systems. Bacterial 3D printing represents an innovative bio-printing method, with the goal of creating materials using a bio-ink composed of bacterial cells and various types of hydrogels. The integration of these two disciplines gives rise to the field of Engineered Living Materials (ELM), which aims to create three-dimensional structures combining the functionalities of living organisms with the mechanical properties of the material used. In this context, this thesis work focuses on the design of ELM with biosensor functionality, with a specific focus on their potential applications in the agro-industrial sector. This work was conducted at the Laboratory of Bioinformatics and Synthetic Biology at the University of Pavia, in collaboration with the Computational Mechanics and Advanced Materials group. This study proposes the development of ELM capable of detecting a variety of compounds, such as nitrates and phosphates in soil samples, and acetate in complex matrices like digestate. Additionally, it evaluates the applicability of ELM in the field through the simulation of controlled exposure to nutrients and investigates the effectiveness of a biocontainment method. For the fabrication of ELM in this work, a hydrogel composed of sodium alginate and gelatin was employed, while Escherichia coli was chosen as the model organism for sensor engineering, utilizing various laboratory strains. Biosensors constructed in this work were characterized through liquid assays, using red fluorescence (RFP) as a gene reporter, and subsequently, the best candidates were selected. Engineered strains were utilized to produce the respective ELM, which were tested to assess their applicability in complex matrices, including the detection of nitrates in soil samples and acetate in digestate samples. Furthermore, experiments were conducted to evaluate the long-term functionality of ELM outside the controlled laboratory environment, simulating controlled release of nutrients to study its impact on cellular vitality. It was found that slowing down nutrient diffusion allows for maintaining a fluorescent signal over time; however, further optimizations are required. Finally, the issue of dispersal of genetically modified microorganisms into the environment was addressed in the perspective of the direct use of ELM in the field. A physical biocontainment method was proposed in this work, proving to be an effective approach to prevent the dispersal of genetically modified microorganisms.

I progressi ottenuti dalla Biologia Sintetica insieme alle tecniche di 3D Bioprinting costituiscono le basi che stanno rivoluzionando il campo biomedico e l'ambito scientifico nel suo complesso. La Biologia Sintetica si focalizza sulla progettazione e l'ingegnerizzazione di sistemi biologici con caratteristiche specifiche, attraverso l'utilizzo di approcci ingegneristici e tecnologie avanzate di manipolazione del DNA, che mirano a implementare nuove funzionalità o creare nuovi sistemi biologici. La stampa 3D di batteri rappresenta un innovativo metodo di bio-stampa, il cui obiettivo è la creazione di materiali attraverso l'utilizzo di un bio-inchiostro composto da cellule batteriche e idrogel di diversi tipi. L'unione di queste due discipline dà vita al campo dei materiali ingegnerizzati viventi (ELM), che mira a creare strutture tridimensionali che combinano le funzionalità degli organismi viventi con le proprietà meccaniche del materiale utilizzato. In questo contesto si colloca il presente lavoro di tesi, che si concentra sulla progettazione di ELM con funzione di biosensori, con un focus specifico sulle loro potenziali applicazioni nel settore agroindustriale. Questo lavoro è stato svolto presso il Laboratorio di Bioinformatica e Biologia Sintetica dell'Università di Pavia, in collaborazione con il gruppo di Meccanica Computazionale e Materiali Avanzati. In questo studio viene proposto lo sviluppo di ELM in grado di rilevare una varietà di composti, come nitrati e fosfati in campioni di terreno, e l'acetato in matrici complesse come il digestato, valutando inoltre l'applicabilità degli ELM sul campo attraverso la simulazione di una esposizione controllata dei nutrienti e l'indagine sull'efficacia di un metodo di biocontenimento. Per la fabbricazione degli ELM in questo lavoro, è stato impiegato un idrogel composto da sodio alginato e gelatina, mentre \textit{Escherichia coli} è stato scelto come organismo modello per l'ingegnerizzazione dei sensori, utilizzando diversi ceppi di laboratorio. I biosensori costruiti in questo lavoro sono stati caratterizzati tramite saggi in liquido, utilizzando la fluorescenza rossa (RFP) come gene reporter, e successivamente sono stati selezionati i migliori candidati. I ceppi ingegnerizzati sono stati utilizzati per produrre i relativi ELM, che sono stati testati per valutarne l'applicabilità su matrici complesse, includendo la rilevazione di nitrati in campioni di terreno e di acetato in campioni di digestato. Inoltre, sono stati condotti degli esperimenti per valutare la funzionalità nel tempo degli ELM al di fuori dell'ambiente controllato di laboratorio, simulando un rilascio controllato dei nutrienti per studiare l'impatto sulla vitalità cellulare. È emerso che un rallentamento della diffusione dei nutrienti consente di mantenere un segnale fluorescente nel tempo, tuttavia sono necessarie ulteriori ottimizzazioni. Infine, si è affrontata la questione della dispersione nell'ambiente dei microrganismi geneticamente modificati, nell'ottica dell'utilizzo diretto degli ELM sul campo. In questo lavoro, è stato proposto un metodo di biocontenimento fisico che si è dimostrato un approccio efficace per prevenire la dispersione di microrganismi geneticamente modificati.