Applicazione di una tecnologia microfluidica single-cell per la valutazione dell’impatto di anticoagulanti, tempistiche e temperature di conservazione su materiale ematico contenente cellule della linea MDA-MB 231

Le cellule tumorali circolanti (CTCs) sono un evento estremamente raro all’interno della circolazione sistemica di pazienti oncologici. Esse si riscontrano in pazienti affetti da cancro come frazione cellulare circolante col potenziale di diffondere verso vari tessuti e dar luogo a metastasi. La biopsia liquida applicata all’isolamento delle CTCs consente di ottenere informazioni sullo stato della malattia senza ricorrere ad una tecnica invasiva per il prelievo di un campione di tessuto. L’isolamento e lo studio di CTCs sono fattori chiave per identificare l’aggressività di un tumore, lo stadio di progressione della malattia e l’identificazione di possibili terapie target per un paziente oncologico. Diverse tecniche di biopsia liquida sono in grado di effettuare un arricchimento del campione basandosi su proprietà fisiche o biologiche. Inoltre, viene reso possibile l’isolamento di singole CTCs sfruttando gli antigeni di membrana espressi da tale popolazione. Tra le varie tecniche di biopsia liquida oggi conosciute, nessuna è però in grado di isolare singole CTCs discriminando il grado di acidificazione derivante da un incremento della glicolisi aerobia nelle cellule tumorali (effetto Warburg). Lo strumento Lighthouse Biotech (LB) impiegato nel presente studio integra un approccio di microfluidica per inglobare all’interno di minuscole droplets le singole cellule contenute in un campione di sangue. Segue poi una fase di incubazione delle gocce generate in fase di emulsificazione per permettere alle cellule tumorali contenute nel campione di avviare la glicolisi aerobia con secrezione di lattato nel microambiente delimitato dalla goccia. Infine, lo strumento è in grado di separare le gocce contenenti cellule tumorali basandosi sulla misura raziometrica del pH restituita dalla goccia marcata con un fluoroforo pH-dipendente. Il riconoscimento pH- dipendente viene svolto da un fascio laser, mentre il processo di separazione è mediato da impulsi elettrici che agiscono sui dipoli delle gocce e ne provocano lo spostamento verso un canale di raccolta. Tale strumento è stato impiegato nel presente studio per valutare lo stato di conservazione di campioni di sangue intero contenenti una frazione di cellule tumorali (MDA-MB 231). Le condizioni saggiate nel presente studio sono state l’impiego di diverse soluzioni anticoagulanti (EDTA, ACD-A, CPD-A); diverse temperature di conservazione (-80°C, 4°C, temperatura ambiente) e l’analisi dopo diversi tempi (0, 24, 48 e 72 ore). Le informazioni ottenute dal presente studio sono relative alla numerosità cellulare e al grado di acidificazione riscontrato in ogni campione. Riguardo agli anticoagulanti impiegati, l’EDTA si è rivelato il meno affidabile, alterando il metabolismo del campione (diminuzione dell’acidità delle droplets contenenti cellule MDA-MB 231) a diversi tempi di analisi e a diverse temperature. Il CPD-A restituisce un grado di conservabilità del campione accettabile ma solo a tempi di analisi inferiori alle 48 ore dal prelievo e oltretutto l’effetto di tale conservante è temperatura-dipendente. L’ACD-A, infine, si è rivelato l’anticoagulante più stabile, mantenendo il medesimo grado di acidificazione nell’ambiente extracellulare fino al tempo di analisi di 72 ore dal prelievo. La temperatura ha effetti trascurabili sul grado di conservazione dei campioni, con migliori performance nel caso di conservazione a 4°C; mentre il congelamento del campione non altera la funzionalità metabolica delle cellule.