Gating e farmacologia dei canali protonici: approcci di purificazione e cristallizzazione di canali Hv1 da specie diverse

Voltage-gated proton channel Hv1 is a proton-selective ion channel that mediates H+ proton extrusion from the mammalian cells. This channel is a homodimer, composed of two S1-S4 voltage-sensory domains, each having its pore. The Hv1 activity is linked to various neuroinflammatory diseases as well as cancer, making it a prospective target for treating multiple diseases. While the three- dimensional protein structure of the closed conformation of the chimeric mouse Hv1 channel (mHv1cc) has been determined and carachterized, little is known about the open conformation structure. The recent discovery of Hv1 channels in fungi Aspergillus oryzae and Suillus luteus provides an opportunity to study the open Hv1 conformation due to their unique features in gating mechanism and similarity to the human Hv1 channel. In addition, recent studies on mHv1cc allowed the development of novel inhibitors. Among such inhibitors, two (PNX52429 and PNX61442 (El Chemaly et al., 2023)) were obtained and tested as a potential therapy against cancer. While functional studies revealed efficient inhibition of the channel, currently no information on the positioning of these molecules inside the channel is present. In this thesis project, we set up and optimized a purification scheme of fungal Hv1 channels to obtain crystallization-grade protein. We performed molecular subcloning of Hv1 cDNA from A. oryzae and S. luteus to obtain mEGFP-fused as well as His8-tagged pPICZa vector constructs, allowing expression and efficient purification of the expressed proteins from Pichia pastoris cells. The transformed P. pastoris colonies were screened for the highest levels of fungal Hv1 expression. In addition, we performed condition screening of P. pastoris cell culture to determine the most suitable conditions for efficient expression of the fungal Hv1 channel in the cells. We performed a thermal stability assay of the A. oryzae Hv1 (AoHv1) combined with fluorescent size-exclusion chromatography to screen for the most suitable detergent, as well as for any additives that improve the stability and monodispersity of the AoHv1 channel during the membrane solubilization phase. The mEGFP-fused AoHv1 protein was purified using a GFP-nanobody trap binding with subsequent cleavage of the tag, followed by chromatographic purifications. In addition, purification trials were performed on mouse chimeric Hv1 (mHv1cc) for the efficient purification of the channel and removal of dihydroxyacetone synthase contaminant that is known to be co-purified together with Hv1 when produced in P. pastoris SMD1163H strain. Finally, we set crystallization trials of mHv1cc together with novel Hv1 inhibitors, PNX52429 and PNX61442, that block the proton conduction pathway of the channel. The chimeric protein was expressed in transformed P. pastoris cells, and the desired purity was obtained by adapting imidazole concentration during reverse IMAC together with chromatography steps. We successfully produced protein crystals and studied their X-ray structure, despite the absence of the inhibitors in the crystal structure. The results of this thesis provide preliminary work for further purification and crystallization of fungal Hv1 channels, allowing to unveiling crystal structure of the channel. This, in turn, will provide means to study the gating stages of the channel from structural point of view. The mHv1cc crystallization trials provide the platform for understanding the conditions that are required to accommodate the channel inhibitors during crystal formation. As a result, future studies will allow to obtain the X-ray structure of the channel-inhibitor complex.

Il canale protonico Hv1 è un canale ionico che media l'estrusione di protoni H+ nelle cellule di mammifero. Questo canale è un omodimero, composto da due domini del sensore del voltaggio S1-S4, ognuno dei quali contribuisce con un poro permeante. L'attività di Hv1 è associata a malattie neuroinfiammatorie e al cancro, rendendolo un bersaglio promettente per il trattamento di molteplici patologie. Mentre la struttura tridimensionale della conformazione chiusa del canale Hv1 chimerico murino (mHv1cc) è stata determinata e caratterizzata, si sa poco sulla struttura della conformazione aperta. La scoperta di canali Hv1 nei funghi A. oryzae e S. luteus offre l'opportunità di studiare la conformazione aperta di Hv1 grazie alle loro caratteristiche uniche nel meccanismo di gating e alla somiglianza strutturale con il canale Hv1 umano. Recenti studi su mHv1cc hanno permesso lo sviluppo di nuovi inibitori. Tra questi inibitori, due (PNX52429 e PNX61442) sono testati come potenziale terapia contro il cancro. Sebbene studi funzionali abbiano rivelato un'efficiente inibizione del canale, al momento non è presente alcuna informazione sulla posizione di queste molecole all'interno del sito di binding della proteina. In questo progetto, abbiamo messo a punto e ottimizzato uno schema di purificazione di canali Hv1 fungini per ottenere una proteina adatta alla cristallizzazione. Abbiamo clonato il cDNA di Hv1 da A. oryzae e S. luteus per ottenere costrutti fusi con mEGFP e una tag di istidine, consentendo l'espressione e la purificazione delle proteine espresse da cellule di P. pastoris. Le colonie di P. pastoris trasformate sono state testate per isolare quelle con livelli più alti di espressione dell'Hv1 fungino. Inoltre, abbiamo eseguito uno screening delle condizioni di coltura di P. pastoris per determinare le condizioni più adatte per l'espressione efficiente del canale Hv1 fungino nelle cellule. Abbiamo eseguito un test di stabilità termica di Hv1 di A. oryzae (AoHv1) combinato con cromatografia di esclusione dimensionale fluorescente per selezionare il detergente più adatto, nonché eventuali additivi che migliorano la stabilità e la monodispersione del canale AoHv1 durante la fase di solubilizzazione della membrana. La proteina AoHv1 fusa con mEGFP è stata purificata utilizzando la sua affinità per una resina a cui è stato immobilizzato un nanobody specifico per la GFP, con successiva scissione del tag, seguita da purificazioni cromatografiche. Sono stati eseguite purificazioni sul costrutto mHv1cc per l'efficiente purificazione di canale e la rimozione di contaminante di diidrossiacetone sintasi che è noto essere co-purificato insieme all'Hv1 quando prodotto nel ceppo SMD1163H di P. pastoris. Infine, abbiamo tentato delle prove di cristallizzazione di mHv1cc insieme a nuovi inibitori di Hv1, PNX52429 e PNX61442, che bloccano la permeazione dei protoni nel canale. La proteina chimerica è stata espressa in cellule P. pastoris trasformate e la purezza desiderata è stata ottenuta adattando la concentrazione di imidazolo durante uno step di IMAC inversa insieme ai passaggi di cromatografia. Abbiamo prodotto con successo cristalli di proteine e studiato la loro struttura X-ray, nonostante l’assenza degli inibitori nel cristallo. I risultati di questa tesi forniscono un lavoro preliminare per una purificazione e cristallizzazione ulteriore dei canali fungali Hv1, permettendo di mettere le basi per svelare la struttura cristallina del canale. Questo, a sua volta, fornirà i mezzi per studiare il meccanismo di gating del canale dal punto di vista strutturale. Le prove di cristallizzazione di mHv1cc forniscono la piattaforma per comprendere le condizioni necessarie per accomodare gli inibitori del canale durante la formazione dei cristalli. Studi futuri consentiranno di ottenere la struttura X-ray del complesso canale-inibitore, un passo importante nello sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento di diverse patologie.