Valutazione sull'uso dello switch di esoni mediato dalla Cre recombinasi per la generazione di un topo knock-in condizionale per il gene Impad1

The Cre-mediated genetic switch combines the ability of Cre recombinase to stably invert or excise a DNA fragment depending upon the orientation of flanking mutant loxP sites. In this thesis, this strategy has been tested in vivo with the aim to generate a conditional knock-in mouse for a missense mutation in the Impad1 gene causing a skeletal dysplasia. A targeting construct was generated in which the Impad1 exon 2 and an inverted exon 2* containing the point mutation was flanked by the mutant loxP sites is expected to be stably inverted leading to the activation of the mutated exon. The targeting vector was used to generate heterozygous floxed mice in which inversion of the wild-type with the mutant exon has not occurred yet. To generate the Impad1 knock-in mouse, floxed animals were mated to a global Cre-deleter mouse strain for stable inversion and activation of the mutation. Unexpectedly, the phenotype of homozygous Impad1 knock-in animals overlaps with the lethal phenotype of an Impad1 knock-out mouse. Expression studies by qPCR and RT-PCR demonstrated that mutant mRNA underwent abnormal splicing leading to the synthesis of non-functional proteins. Thus, the skeletal phenotype was not caused by the missense mutations, but by aberrant splicing. These data demonstrate that the Cre mediated genetic switch strategy should be considered cautiously for the generation of conditional knock-in mice.

Lo switch esonico mediato dal sistema Cre combina la capacità della Cre recombinasi di invertire stabilmente o excidere un frammento di DNA sulla base dell’orientamento di due siti mutanti che fiancheggiano la sequenza, definiti come loxP. In questa tesi, questa strategia è stata testata in vivo con lo scopo di generare un topo knock-in condizionale per una mutazione missenso nel gene Impad1, causativo di una displasia scheletrica. E’ stato generato il costrutto target nel quale è presente l’esone 2 del gene Impad1 e l’esone 2* invertito contenente la mutazione puntiforme, fiancheggiato dai due siti mutati loxP con un orientamento definito testa a testa. Quando è presente la Cre recombinasi, il DNA fiancheggiato dai siti loxP mutati si prevede che sia invertito stabilmente, portando all’attivazione dell’esone mutato. Il vettore target è stato usato per generare dei topi eterozigoti “floxed” nei quali l’inversione del wild-type con l’esone mutato non si è ancora verificata. Per generare il topo Impad1 knock-in, animali “floxed” sono stati accoppiati con una linea di topi contenenti la Cre recombinasi per un’inversione stabile e per l’attivazione della mutazione. Inaspettatamente, il fenotipo degli animali omozigoti Impad1 knock-in si sovrappone con il fenotipo letale del topo Impad1 knock-out. Effettuati dunque studi di espressione tramite qPCR e RT-PCR, è stato dimostrato che l’mRNA mutato subisce uno splicing alternativo che porta alla sintesi di proteine non funzionali. Perciò, il fenotipo scheletrico non è causato dalla mutazione missenso, ma dallo splicing alternativo. Questi dati dimostrano inoltre che, lo switch genetico mediato da Cre dovrebbe essere considerato con cautela per la generazione di topi knock-in condizionali.