Molecular and thermodynamic comparison of in vitro and ex vivo TTR amyloid fibrils

Systemic amyloidosis are a group of diseases caused by the extracellular deposition of insoluble aggregates called amyloid fibrils. Every amyloid disease is related to a specific protein that undergoes conformational changes and rearranges into a beta-sheet structure that inevitably deposits in organs and tissues determining their toxicity and failure. One of the precursor proteins involved in the deposition of amyloid fibrils is transthyretin (TTR), which is a tetrameric plasma protein, synthesized predominantly by the liver, responsible for the transport of both thyroid hormones and indirectly implicated in vitamin A (retinol) transport following the formation of a stable complex with plasma retinol-binding protein. All known variants arise from a single AA substitution due to single point mutations in the coding region of the TTR gene. The first mechanism to describe TTR fibrils formation was suggested by Professor Jeffrey Kelly in 1992. This model was based on in vitro experiments conducted at low pH conditions, therefore non-physiological. Their original study suggested that amyloid fibrils could be formed under circumstances that could mimic the acidic environment of a lysosome and excluded the possibility that the protein could be degraded by proteolysis even though the analysis of ex vivo fibrils highlighted the presence of truncated species of TTR. Since this method yields almost no clearly defined amyloid fibrils and does not take into account the presence of proteolytic fragments, the hypothesis of a different proteolysis-mediated mechanism was suggested by Professor Bellotti’s group and brought to the discovery of plasmin as a putative enzyme that selectively cleaves human TTR between residues Lys48 and Thr49 under physiological conditions in vitro, leading to the formation of genuine amyloid fibrils. Since the first description of the mechano-enzymatic mechanism, the characterization of the fragments formed after proteolysis, their ability to aggregate and therefore the exact composition of TTR amyloid fibrils is still not completely clear. At first, the thermodynamic stability and denaturation propensity of the soluble precursor protein wild-type TTR and its V122I variant in the presence of the chaotropic agent guanidine thiocyanate was determined. Moreover, the analysis of specific peptides inside TTR fibrils using tandem mass spectrometry allowed the comparison of the different peptide composition in aggregates formed according to both Kelly’s and mechano-enzymatic methods. Further experiments, focused on the evaluation of the stability of aggregates obtained by the two in vitro methods showed a higher stability for the mechano-enzymatic fibrils, which was found to be similar to that estimated for ex vivo fibrils. The results obtained allowed to exclude Kelly’s method as a plausible mechanism for fibrils formation and strengthened the hypothesis of a mechano-enzymatic mechanism underlying TTR amyloidogenesis.

Le amiloidosi sono un gruppo di patologie caratterizzate dal deposito extracellulare di materiale insolubile il quale porta alla compromissione del funzionamento degli organi interessati e talvolta alla morte dell’individuo. Ogni forma di amiloidosi è correlata ad una specifica proteina che va incontro ad un cambio conformazionale e assume una struttura fibrillare formata da ß-foglietti con specifiche proprietà chimico-fisiche e caratteristiche strutturali. Una tra le proteine in grado di dare origine ad aggregati fibrillari nell’uomo è la transtiretina (TTR), una proteina globulare sintetizzata principalmente dal fegato, coinvolta nel trasporto degli ormoni tiroidei (T3 e T4) e indirettamente implicata nel trasporto del retinolo (vitamina A). Ad oggi più di un centinaio di mutazioni sono state identificate all’interno della sequenza genica della TTR e la maggior parte di queste portano allo sviluppo di neuropatie sistemiche e/o cardiomiopatie con manifestazioni molto gravi, che compromettono la vita del paziente. Il meccanismo responsabile della fibrillogenesi è tutt’ora un argomento molto dibattuto; il primo meccanismo di formazione delle fibrille amiloidi è stato studiato dal professor Jeffrey Kelly nel 1992, basato su esperimenti in vitro condotti in condizioni a pH acido, pertanto non fisiologico. Tale lavoro suggeriva la possibilità di formazione di fibrille tramite dissociazione del tetramero, seguita da parziale denaturazione del monomero, escludendo però la possibilità che un taglio proteolitico fosse coinvolto all’interno del processo di fibrillogenesi. Attraverso ulteriori studi, l’ipotesi di un taglio proteolitico coinvolto nella formazione di fibrille amiloidi ha portato all’identificazione della plasmina come enzima responsabile della proteolisi tra la posizione 48 e 49 della catena amminoacidica della proteina. La combinazione di proteolisi e forze biomeccaniche ha poi permesso di generare fibrille amiloidi autentiche in condizioni di pH, forza ionica e temperature fisiologiche. Dallo sviluppo del metodo meccano-enzimatico, la caratterizzazione dei frammenti formati durante il processo proteolitico, la loro capacità nell’aggregare e perciò la loro esatta composizione non sono state completamente definite. Lo studio della TTR wild-type (WT) e della sua variante V122I in presenza di denaturante, ha permesso di caratterizzare le loro differenze in termini di stabilità termodinamica. Inoltre, attraverso l’analisi tramite spettrometria di massa tandem di peptidi specifici presenti all’interno delle fibrille di TTR, è stato possibile confrontare il materiale fibrillare ottenuto dai due metodi (Kelly e meccano-enzimatico) dal punto di vista della loro differente composizione. Infine, l’estrazione e la caratterizzazione di fibrille di TTR ex vivo ha permesso di confrontare le stabilità dei tre materiali e di escludere il metodo Kelly dall’essere considerato un meccanismo plausibile per la formazione di fibrille amiloidi in vitro.