Strategie diagnostiche innovative nella prevenzione dell’incompatibilità materno-fetale: utilizzo della tecnica di Real-Time PCR e validazione di nuove metodologie per la definizione del genotipo RHD fetale da plasma materno.

To date, the analysis of foetal genomic DNA, obtained from amniocentesis or chorionic villus sampling, is the gold standard method to detect any foetal chromosome abnormalities. However, the invasive prenatal methods (amniocentesis or chorionic villous sampling) used to obtain the biological material for these tests are associated with a risk of miscarriage which varies from 0.5% to 1%. The discovery of cell free foetal DNA (cff-DNA) in the peripheral maternal circulation opened a new field of research in molecular biology, aimed to detect foetal anomalies and to determine foetal RHD genotype by non-invasive prenatal testing. Currently, cff-DNA analysis requires laborious and time and costs-expensive methodologies. Moreover, only few laboratories have already introduced these non-invasive screening tests in their clinical routine. As result, to date, reporting times are too long. To cope with this problem, and with the increasing demands, advanced technologies, easily accessible and supporting high throughput screenings, need to be developed. In order to prevent the haemolytic disease of the foetus and newborn (HDFN) and to manage pregnancies identified as “at risk”, the prenatal determination of the foetal RHD genotype is essential. The sensitivity, specificity and speed of execution of Real-Time PCR, make this technique the method of choice for this test. On the best of our knowledge, the Immunogenetics Laboratory of the IRCCS Policlinico San Matteo in Pavia is the only Italian public facility performing, from year 2012, this test. During the internship period: - Once acquired the necessary skills to run this innovative technology, I collaborated for typing of foetal RHD genotype in 20 maternal plasma samples. From September to June, two special cases have been analyzed: in one has been detected the presence of a rare antigenic variant, in the second, for the first time, foetal RHD genotype on a twin pregnancy at risk of HDFN was determined. - The Laboratory participated at first International External Quality Control for the definition of foetal RHD genotype. The results obtained have shown the high accuracy of this analytical method. - Automated platforms have been implemented for the extraction of cff-DNA and preparation of Real-Time PCR. In particular, for the validation of Maxwell® 16 System automatic extractor, 15 cff-DNA from as many maternal plasma samples have been analyzed simultaneously with both manual and automated extraction methods. For the validation of the automated liquid handling protocol executed with the Robot Tecan Freedom Evo® 75 two independent aliquots of 4 maternal plasma samples have been analyzed. In particular, the experiment was carried out double-blind using Real-Time PCR for the analysis of cff-DNA from maternal plasma, and PCR-SSP on genomic DNA, extracted from amniocentesis or from chorionic villous sampling from the same pregnant women. The software R has been used for graphical and statistical data analyses. When successfully validated, this automated process will improve the efficiency of the Immunogenetics Laboratory and it will provide an accurate diagnostic result, in a shorter-reporting time. Nowadays, the non-invasive foetal RHD genotyping from maternal plasma is performed only in pregnant woman at high risk of HDFN. Cost reduction of this test will allow its introduction in clinical routine as a diagnostic screening test. Thereby, Laboratory of Immunogenetics and Transfusion Medicine Service (SIMT) will be able to offer it to all serologically RhD negative pregnant women.

L’analisi del DNA genomico fetale estratto tramite amniocentesi o villocentesi è, ad oggi, il metodo d’eccellenza per evidenziare eventuali patologie cromosomiche nel feto. Tuttavia, le metodiche ostetriche invasive attuate per ottenere il materiale biologico su cui condurre questi test sono associate ad un rischio di aborto che varia dallo 0.5% all’1%. La scoperta dell’esistenza di DNA libero fetale (cff-DNA, cell free fetal DNA) nella circolazione periferica materna ha aperto un nuovo campo di ricerca in biologia molecolare, al fine di individuare anomalie a carico del feto o di determinare il genotipo RHD fetale con procedure diagnostiche non invasive di diagnosi prenatale. Le metodiche attualmente disponibili per l’analisi del cff-DNA sono laboriose, costose con tempi di esecuzione ancora troppo lunghi essendo pochi i laboratori che le hanno introdotte nella routine clinica. Per far fronte alle richieste di un numero sempre maggiore di pazienti che richiedono test di screening non invasivi, è necessaria l’adozione di tecnologie avanzate, facilmente accessibili e in grado di ridurre i tempi di refertazione per consentirne una vasta applicazione in campo clinico. Nella prevenzione della malattia emolitica del neonato (MEN), la determinazione del genotipo RHD fetale da cff-DNA con metodica Real-Time PCR rappresenta il metodo d’elezione per sensibilità, specificità e velocità di esecuzione. Il Laboratorio di Immunogenetica della Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo di Pavia, è a nostra conoscenza, l’unica struttura pubblica in Italia che effettua dal 2012 il test per la determinazione del genotipo RHD fetale da plasma materno. Durante il periodo di internato di tesi sperimentale: - Acquisite le competenze indispensabili per l’esecuzione di questa tecnologia innovativa, ho collaborato alla determinazione del genotipo RHD fetale in 20 campioni di plasma materno. Da settembre a giugno, sono stati analizzati due casi particolari: in uno è stata rilevata la presenza di una variante antigenica rara, nel secondo è stato determinato per la prima volta l’RHD fetale in una gravidanza gemellare a rischio di MEN. - Il Laboratorio ha partecipato al primo programma Controlli Qualità Esterni internazionalmente riconosciuti per la determinazione del genotipo RHD fetale. I risultati ottenuti hanno dimostrato l’accuratezza del metodo analitico. - Sono state implementate piattaforme automatizzate per l’estrazione del cff-DNA e l’allestimento della reazione di Real-Time PCR. In particolare, per la validazione dell’estrattore automatico Maxwell® 16 System sono stati analizzati in doppio 15 campioni di plasma materno. Per la validazione del Robot Tecan Freedom Evo® 75 sono state analizzate due aliquote indipendenti di quattro campioni di plasma materno. Inoltre, è stato possibile confrontare la tipizzazione RHD, determinata con Real-Time PCR su cff-DNA estratto da prelievo materno, con i risultati ottenuti da PCR-SSP su DNA genomico fetale estratto da amniociti o villi coriali. Una volta superato il percorso di validazione, i processi di automazione miglioreranno la qualità del lavoro, saranno in grado di fornire un risultato diagnostico accurato, riducendo al tempo stesso i tempi di refertazione necessari per l’analisi dei campioni. Attualmente, la procedura di determinazione non invasiva dell’RHD fetale da plasma materno è utilizzata per la corretta gestione solo delle gravide individuate ad alto rischio di MEN. La riduzione dei costi consentirà l’introduzione del test nella routine clinica come screening diagnostico in tutte le gravide sierologicamente RhD negative afferenti al Laboratorio di Immunogenetica del Servizio di Immunoematologia e Medicina Trasfusionale (SIMT), permetterà di evitare inutili trattamenti farmacologici e di risparmiare sulla somministrazione di immunoglobuline anti-RhD, se non necessarie.