Sviluppo di un modello di midollo osseo 3D per lo studio della trombopoiesi umana ex vivo

In the present thesis work, we created silk films functionalized by coating or distinct incorporation of collagen I, fibrinogen, laminin, collagen IV, fibronectin to evaluate the influence of the components of the extracellular matrix on megacaryocyte adhesion and on the formation of proplatelets, demonstrating that megakaryocytes actively interact with each component of the extracellular matrix in both functionalization conditions. The results obtained from the experiment with silk films led us to the construction of a three-dimensional model to better examine the interaction between the bone marrow microenvironment and megakaryocytes. We then reproduced the bone marrow microvasculature using silk microtubes functionalized with components of the extracellular matrix and, after demonstrating their biocompatibility and ability to adequately support the megakaryocyte adhesion, we assembled around them a silk sponge to recreate the spongy architecture of the bone marrow. Blood flow was mimed by the perfusion of culture medium at a shear stress of 60 s-1, which greatly improved the yield of platelets released by the 3D system compared to the static condition. The platelets produced ex vivo were characterized from a morphological point of view, through different microscopic methods, and from a functional point of view, through the use of in vitro assays that demonstrated their ability to activate. Our system was therefore able to successfully generate functional platelets, proving to be a valid tool for the study of human thrombopoiesis.

Nel presente lavoro di tesi, per valutare l’influenza dei componenti della matrice extracellulare sull’adesione megacariocitaria e sulla formazione di propiastrine, abbiamo creato film di seta funzionalizzati mediante coating o incorporazione distinta di collagene di tipo I, fibrinogeno, laminina, collagene IV, fibronectina, dimostrando che i megacariociti interagiscono attivamente con ciascun componente della matrice extracellulari in entrambe le condizioni di funzionalizzazione. I risultati ottenuti dall’esperimento con i film di seta ci hanno spinti verso la costruzione di un modello tridimensionale per meglio esaminare l’interazione tra microambiente midollare e megacariociti. Abbiamo quindi riprodotto la microvascolatura midollare mediante microtubi di seta funzionalizzati con componenti della matrice extracellulare e, dopo averne dimostrato la biocompatibilità e la capacità di sostenere adeguatamente l’adesione megacariocitaria, abbiamo assemblato attorno ad essi una spugna di seta per ricreare l’architettura spongiosa del midollo osseo. Il flusso sanguigno è stato mimato tramite la perfusione di terreno di coltura a una velocità di taglio pari a 60s-1, che ha migliorato notevolmente la resa di piastrine rilasciate dal sistema 3D rispetto alla condizione statica. Le piastrine prodotte ex vivo sono state caratterizzate sia da un punto di vista morfologico, attraverso diverse metodiche microscopiche, che da un punto di vista funzionale, mediante l’uso di saggi in vitro che hanno dimostrato la loro capacità di attivarsi. Il nostro sistema è stato quindi capace di generare con successo piastrine funzionali, rivelandosi uno strumento valido per lo studio della trombopoiesi umana.