Deletion of the extra sequence in B. subtilis γ-glytamyl transferase: effect on protein stability and catalytic activity (La delezione dell'extra sequence nella gamma-glutamiltranspeptidasi di B. subtilis: l'effetto sulla stabilità e sull'attività catalitica della proteina)

GGTs are ubiquitously diffused γ-glutamyltranspeptidase which are able to remove the γ-glutamyl group from. Among γ-glutamyl compounds, we found poly-γ-glutamate, an high molecular weight polymer made of γ-glutamic acid residues that has several biological function: it protects bacteria from toxic metal ions, it absorbs water and it creates also a protective barrier that shields microorganisms from host immune system. Thanks to all these chemical properties, γPGA can be considered a valuable resource, suitable for many biotechnological applications. Furthermore, since γPGA is an high molecular weight polymer made of γ-glutamic acid monomers, it can be exploited as a source of γ- glutamyl groups for the γ-glutamylation of several compounds. Bacterial GGTs are already used as catalyst in this kind of reactions, because they are soluble, stable in high salt and high temperature conditions and greatly simplify the process. Γ-glutamylation makes the modified molecules more stable in the body fluids and more resistant to proteases degradation; it increases the taste and flavor of food and drastically reduces the bitterness of food supplements. The use of γPGA as γ-glutamic group donor in GGTs mediated γ-glutamylation reaction, is a really promising application of this biopolymer, mainly because of its bioavailability and ecological sustainability. However, not all bacterial GGTs are able to degrade γPGA in glutamate monomers, even if they are very conserved enzymes: B. subtilis GGT can use poly-γ-glutamic acid as substrate, while E. coli GGT not. Probably this opposite behavior is due to structural dissimilarity between the two proteins: in fact, even if they share huge sequence homology, E. coli GGT has a domain, called the lid loop, that is totally absent in B. subtilis GGT. On the other hand, B. subtilis GGT possess a region, the extra sequence, that is missing in E. coli protein. Understanding the mechanism of catalysis and the structural features that are responsible for enzymatic activity will give us an hint on how to modify bacterial GGTs enzymes to make them more processive and adapted for different substrates, as for example γPGA, in the perspective to exploit them in food and pharmaceutical industry. In this study, we wanted to test if the presence of the extra sequence allows Bacillus subtilis GGT to use γPGA as substrate, maybe recruiting it into its catalytic site. To verify this hypothesis, we modified the GGT of Bacillus, deleting the region corresponding to the extra sequence with the aim to test the mutant deleted protein for the ability to degrade γPGA into glutamate monomers. The extra sequence deletion made the mutant protein insoluble and we were not able to purify and test it. However, this result indicates that the extra sequence is necessary for the correct folding of the protein and it is also involved in autocatalysis and maturation of the enzyme.

Le GGTs, γ-glutamiltranspeptidasi, sono proteine conservate dai battteri all’uomo, in grado di rimuovere il gruppo γ-glutamile dai composti γ-glutamilici. Dei composti γ-glutamilici fa parte anche il poli-γ-glutammato, il γPGA, un polimero ad alto peso molecolare costituito da residui di γ-glutammato con numerose funzioni biologiche: il γPGA protegge i batteri dagli ioni metallici, assorbe l'acqua prevenendo la disidratazione e crea anche una barriera protettiva che protegge i microrganismi dal sistema immunitario dell'ospite. Grazie a queste proprietà chimiche, il γPGA è adatto a molte applicazioni biotecnologiche. Inoltre, poiché è un polimero ad alto peso molecolare formato da monomeri di acido γ-glutammico, il γPGA può essere sfruttato come fonte di gruppi γ- glutamilici per la γ-glutamilazione di diversi composti. Le GGT batteriche sono già utilizzate come catalizzatori in questo tipo di reazioni, perché sono solubili, stabili a temperature elevate e ad alte concentrazioni saline. La γ-glutamilazione rende le molecole modificate più stabili nei fluidi corporei e più resistenti alla degradazione da parte delle proteasi. Inoltre, aumenta il gusto e il sapore del cibo e riduce drasticamente l'amarezza degli integratori alimentari a base di ammino acidi. La possibilità di utilizzare il γPGA come donatore di gruppi γ-glutammici in questo genere di reazioni mediate dalle GGTs, è un aspetto molto promettente dello sfruttamento del γPGA in ambito industriale, soprattutto grazie alla sua biodisponibilità e alla sua sostenibilità dal punto di vista ecologico. Tuttavia, non tutte le GGT batteriche sono in grado di degradare il γPGA in monomeri di glutammato, anche se si tratta di enzimi molto conservati: la GGT di B. subtilis è in grado di utilizzare l'acido poli-γ-glutammico come substrato, mentre la GGT di E. coli no. Probabilmente questo comportamento opposto è dovuto alla diversità strutturale tra le due proteine: infatti, anche se condividono un’estesa omologia di sequenza, la GGT di E. coli ha un dominio, chiamato lid loop, che è totalmente assente nella GGT di B. subtilis. D'altra parte, la GGT di B. subtilis possiede una regione, denominata extra sequence, che manca nella GGT di E. coli. La comprensione del meccanismo della catalisi e delle caratteristiche strutturali che sono alla base dell'attività enzimatica delle GGT può dare un’indicazione su come modificare questi enzimi per renderli più processive e adattarli a diversi substrati, come ad esempio il γPGA, nella prospettiva di sfruttarli estensivamente nell’industria alimentare e farmaceutica. In questo studio, abbiamo voluto verificare se la presenza della extra sequence sia alla base della capacità della GGT di Bacillus subtilis di utilizzare il γPGA come substrato. Perciò abbiamo modificato la GGT di Bacillus, eliminando la regione corrispondente alla extra sequence con lo scopo di testare se la proteina mutante consevasse la capacità di degradare γPGA in monomeri di glutammato. Tuttavia, la delezione apportata ha reso la proteina mutata insolubile e impossibile da purificare e testare. In ogni caso, questo risultato indica che la sequenza supplementare è necessaria per il corretto folding della proteina ed è probabilemte coinvolta nella autocatalisi e attivazione dell’enzima.