Estrazione in fase solida di cianotossine e tossine algali da acque ambientali e determinazione in HPLC-ESI-MS/MS

Aim of the present study is to develop a simple and sensitive method for the simultaneous screening, detection and quantification of six toxins (cyanotoxins and algal toxins), emerging pollutants with different structures and harmful proprieties (hepatotoxicity, neurotoxicity and cytotoxicity). We focalized our attention on 4 microcystins (MC-LR, MC-LW, MC-RR and MC-RR, hepatic cyanotoxins), okadaic acid (OA, a polyketide responsible for diarrheic shellfish poisoning) and domoic acid (DA, neurotoxic tricarboxylic amino acid). The complexity of environmental matrices and the low concentrations detected in those samples (ngL-1) demand a pre-concentration step before the chromatographic analysis, mainly performed by solid-phase extraction (SPE). In this work, a carbonaceous material recently proposed by research group of professor Profumo (HA-C@silica) was tested as SPE phase. This sorbent is prepared using micrometric silica as the support for humic acids (HA), a green and low-cost material, chosen as the carbon source. The procedure for HA-C@silica involves the immobilization of HA onto inorganic particles, followed by thermal treatment (under N2 flow) at 600°C, achieving a mixed-mode material. Preliminary pre-concentration tests were undertaken on tap water samples (250 mL) enriched with 0.8 μgL-1 of each analyte, evaluating the role of different parameters (sorbent amount, extraction pH, composition and volume of the eluent). Extraction was carried out at pH ~3, necessary for the adsorption of DA on the cartridge, using 400 mg of HA-C@silica packed in 3 mL SPE tubes. A single elution (2.5 mL) with MeOH 10% v/v FA provided recovery higher than 75% for all the analytes except for MC-RR (<5%), which is strongly retained in the sorbent material, probably due to the presence of two arginine (basic amino acid) residues in its structure. This analyte is eluted (85%) with a second fraction (2.5 mL MeOH + 30% v/v FA), after a washing step (5 mL of water +10 % NH3). In order to increase the EF, SPE tests were carried out by loading larger sample volumes (400 mL enriched with 0.5 μgL-1 of each analyte), obtaining quantitative recoveries for all the analytes in tap water (R> 85%) and semiquantitative recoveries in river and sea water, due to the presence of interferents that compete for adsorption. Based on these results, a sample volume of 250 mL was used to obtain the best analytical results. After SPE, algal toxins were separated and quantified by HPLC-HESI-MS/MS. For the chromatographic separation Adamas C18-B (2.1 mm × 150 mm, 3.0 μm) column was used, with water and ACN both containing 0.5% v/v FA, as a mobile phase. The MS spectrometer was tuned up by direct injection of individual analyte solutions and ionization of compounds was performed in positive mode. The quantitative analysis of the target compounds was performed in multiple-reaction monitoring (MRM) mode, using the two most intense and characteristic precursor/product ion transitions of each compound obtained from the MS/MS. The single protonated molecular ion [M+H]+ is observed as precursor ion for all the analytes, except for MC-RR, which presented doubly protonated [M+2H]2+ as precursor ion, because it contains two arginine residues in its molecular structure. The main figures of merit selectivity, sensitivity, linearity, recovery and precision are evaluated.

Il presente lavoro di Tesi Magistrale si pone come obiettivo la messa a punto di un metodo analitico di pre-concentrazione e successiva determinazione in HPLC-ESI-MS/MS di cianotossine e tossine algali da acque ambientali. Si tratta di biotossine marine sintetizzate da fioriture algali potenzialmente pericolose (HABs), causate dal riscaldamento globale, dalleutrofizzazione e dallinquinamento. Nel presente lavoro, lattenzione è focalizzata su sei tossine: acido domoico (amminoacido tricarbossilico neurotossico), acido okadaico (polichetide responsabile dellavvelenamento diarroico da molluschi) e 4 microcistine (MC-LR, MC-LW, MC-RR e MC-RR, epatotossiche). Le basse concentrazioni degli analiti nellambiente (ngL-1) richiedono una fase di pre-concentrazione prima dell'analisi cromatografica, eseguita mediante estrazione in fase solida (SPE). In questo lavoro, è stato testato come adsorbente un materiale carbonioso a fase mista recentemente proposto dal gruppo di ricerca della prof.ssa Profumo (HA-C@silica) e ottenuto dalla pirolisi di acidi umici (HA) immobilizzati su particelle di silice micrometrica. Test preliminari di pre-concentrazione sono stati eseguiti su campioni di acqua di rubinetto (250 mL) arricchiti con 0.8 μgL-1 di ciascun analita, valutando il ruolo di diversi parametri, quali quantità di fase adsorbente, pH di estrazione, composizione e volume dell'eluente. L'adsorbimento risulta essere indipendente dal pH per tutti gli analiti ad eccezione di DA, che necessita di condizioni acide. Pertanto, la pre-concentrazione è stata effettuata a pH ~3, usando 400 mg di HA-C@silica impaccati in cartucce SPE da 3 mL. Per quanto riguarda leluizione è stato valutato lutilizzo di MeOH tal quale e con percentuali diverse di acido formico (FA, 0-30% v/v) o ammoniaca (NH3, 0-5% v/v). I risultati hanno evidenziato che una singola eluizione (2.5 mL) con MeOH + 10% v/v FA porti a un recupero superiore al 75% per tutti gli analiti a eccezione di MC-RR (<2%), che è fortemente trattenuta dal materiale adsorbente, poiché differisce dalle altre MCs per la presenza di due residui di arginina (aminoacido basico) nella sua struttura. Questo analita viene eluito (85%) con una seconda frazione (2.5 mL MeOH + 30% v/v FA), dopo una fase di lavaggio (5 mL di acqua + 10 %v/v NH3). Sono stati effettuati anche test SPE con volumi di campione maggiori (400 mL, arricchiti con 0.5 μgL-1 di ciascun analita), ottenendo recuperi quantitativi per tutti gli analiti con acqua del rubinetto (R> 85%) e recuperi semiquantitativi con acque di fiume e di mare, a causa della presenza di interferenti che competono per l'adsorbimento. È stato, perciò, utilizzato un volume di campione di 250 mL che consente buoni recuperi ai livelli di concentrazione studiati, per tutti i contaminanti, in entrambe le matrici. Una volta eluite, le tossine sono state separate e quantificate mediante analisi HPLC-HESI-MS/MS. Per la separazione cromatografica è stata impiegata una colonna Adamas C18-B (2.1 mm × 150 mm, 3.0 μm), utilizzando come fasi mobili acqua e ACN, acidificati con FA a 0.5% v/v. Studi di frammentazione sono stati effettuati tramite iniezione diretta dei singoli analiti e la ionizzazione dei composti è stata eseguita in modalità positiva. L'analisi quantitativa dei composti target è stata eseguita in modalità multiple-reaction monitoring (MRM), utilizzando le due più intense e caratteristiche transizioni ioniche precursore/prodotto di ciascun composto ottenuto dalla MS/MS. Il singolo ione molecolare protonato [M+H]+ è stato osservato come ione precursore per tutti gli analiti, a eccezione di MC-RR, che ha dato uno ione doppiamente protonato [M+2H]2+ come ione precursore. Per il metodo analitico sono state, infine, valutate le principali figure di merito, quali selettività, sensibilità, linearità, recupero e precisione.