Ricerca e determinazione quantitativa di 88 psicofarmaci nelle unghie mediante LC-MS/MS

Aim. The study aims the evaluation of fingernails as alternative keratin matrix to hair in long-term monitoring of psychoactive substances. Methods. A Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) method was developed for the bioanalytical process. After the collection of the excess overhang of nails (1-2 mm, 20-38 mg), the samples were washed twice with organic solvents and then they were immersed in a methanol solution with internal standards and sonicated up to two hours. The solution was then directly injected in the LC-MS/MS system. Mass Spectrometry was set in MRM mode, selecting two transitions for each substance. Ionisation conditions of 89 molecules between antidepressants, antipsychotics and sedative-hypnotics were fixed. The validation criteria parameters of bioanalytical method (selectivity, sensitivity, accuracy, precision, matrix effects) were investigated for each molecules. In vitro dispositions were applied in real cases. 14 volunteers joined the study and declared of being under therapy with one or more drugs under examination during the last two months before sample collection. Results. The method fulfilled the required criteria for validation. Limit of detection (LOD) and Limit of quantification (LOQ) ranged from 0.1 to 50 pg/mg and from 0.1 to 71.9 pg/mg respectively. Concerned to nails real samples analysis, the eleven subjects under therapy declared a total amount of 14 different psychoactive substances (ziprasidone, quetiapine, lorazepam, clotiapine, haloperidol, flurazepam, bromazepam, diazepam, amitriptyline, alprazolam, promazine, chlorpromazine, prazepam). Laboartory results proved their presence in real samples (except for chlorpromazine and prazepam), all the other drugs were detected and quantitated in fingernails. Sertraline was found in two samples but didn’t match with self-declaration in one subject. The subject confirmed that he was under sertraline therapy more than three months before sample collection. The developed method assessed to be highly reliable in chemical-toxicology analysis of fingernails, despite it is a target screening. Conclusion. The study demonstrated that fingernails are a valid alternative matrix to hair in assessing a previous therapeutic consumption of psychoactive substances.

Scopo della tesi. Lo scopo di questo studio consiste nella valutazione delle unghie come matrice cheratinica alternativa ai capelli nel monitoraggio a lungo termine di sostanze psicoattive. Metodi. Il procedimento bioanalitico è stato realizzato mediante metodo cromatografico in fase liquida ad alta pressione accoppiata alla spettrometria di massa a triplo quadrupolo (LC-MS/MS). La preparazione dei campioni ha previsto, dopo l’acquisizione degli stessi (1-2 mm, 20-38 mg) mediante taglio dell’eccesso sporgente dell’unghia, il lavaggio per due volte con solventi organici (diclorometano e metanolo) e la successiva immersione e sonicazione per 2 ore in metanolo in presenza di opportuni standard interni. La soluzione metanolica è stata iniettata direttamente nel un sistema LC-MS/MS. Lo spettrometro di massa è stato impostato nella modalità MRM, selezionando due transizioni per ciascuna sostanza. Sono state definite le condizioni di ionizzazione di 88 molecole appartenenti ai gruppi degli antidepressivi, antipsicotici, ansiolitici-iponotici. Per ciascuna di queste sono stati investigati i principali parametri che sottendono alla validazione di una metodica bioanalitica (selettività, sensibilità, accuratezza, precisione, effetto matrice). Quanto predisposto in vitro è stato applicato all’analisi di campioni reali. Hanno preso parte allo studio 14 volontari che avevano dichiarato di essere in terapia con uno o più farmaci di quelli sottoposti a controllo durante i due mesi precedenti la raccolta dei campioni di unghie. Risultati. Il metodo ha soddisfatto i criteri richiesti per la validazione. Il Limite di Rivelazione (LOD) e il Limite di Quantificazione (LOQ) coprono il range: 0.1-50 pg/mg e 0.1-71.9 pg/mg rispettivamente. In riferimento allo studio di campioni ungueali reali si è osservato che negli 11 soggetti in terapia con psicofarmaci che avevano dichiarato di assumere in totale 14 diversi sostanze psicoattive (ziprasidone, quetiapina, lorazepam, clotiapina, haloperidolo, flurazepam, bromazepam, diazepam, amitriptilina, alprazolam, promazina, clorpromazina, prazepam), le analisi di laboratorio hanno documentato la presenza di quasi tutti questi composti (ad eccezione di clorpromazina e prazepam) pervenendo altresì alla loro determinazione quantitativa nella matrice cheratinica oggetto di studio. Da segnalare che nel corso dei controlli eseguiti è emersa in 2 campioni di unghie la presenza di sertralina, senza alcuna corrispondenza con quanto dichiarato da uno dei due soggetti. Quest’ultimo poi confermò di aver seguito una cura a base di sertralina più di tre mesi prima del campionamento. Queste osservazioni documentano che la metodica da noi predisposta possiede grande valenza nella conduzione di operazioni di screening chimico-tossicologico, seppur limitato alle molecole opportunamente predefinite dal punto di vista dei parametri identificativi/di dosaggio predisposti nella realizzazione dell’analisi LC-MS/MS qui descritta. Conclusioni. Lo studio ha dimostrato che le unghie sono una valida matrice, alternativa al capello, nell’accertamento di assunzioni pregresse di farmaci psicoattivi quando impiegati con finalità terapeutica nei mesi antecedenti il prelievo.