Espressione ricombinante e caratterizzazione funzionale di due DNA glicosilasi coinvolte nella tolleranza allo stress ossidativo in Arabidopsis thaliana

As sessile and photosynthetic organisms, plants are more subject than animals to high levels of oxidative stress due to reactive oxygen species (ROS) generated as result to biotic stresses, exposure to sunlight and metabolic activity. One of the major DNA oxidation damages originated by ROS is the 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8oxoG) adduct, an highly mutagenic lesion that can lead to GC → TA transversions due to error-prone synthesis by replicative DNA polymerases (DNA pols). However, mutations can be avoided with an error-free bypass of the lesion by the concerted action of translesion DNA pols and auxiliary proteins such as the Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). In A. thaliana the only member of the X family of repair DNA polymerases is DNA pol lambda. Moreover, contrarily to humans, A. thaliana has two genes encoding PCNAs. It has been demonstrated that DNA Pol lambda interacts with AtPCNA2 in an error-free mechanism for 8oxoG translesion synthesis operating in A. thaliana. It is also well known that in Eukaryotes the repair of 8oxoG adducts is conducted by a base excision repair (BER) mechanism initiated by DNA glycosylases. The aim of this work is that of a functional characterization of the 8oxoG DNA N-glycosylase 1 (AtOgg1) and the MutY Homolog (AtMutYH), two DNA glycosylases responsible for 8oxoG BER initiation in A. thaliana. To this end we have obtained the recombinant proteins expressing the resynthesized gene in Escherichia coli. For AtOgg1, the resulting protein, purified by affinity chromatography, was used for in vitro DNA glycosylase activity assays using different radiolabeled synthetic substrates. Our preliminary results have highlighted some interesting peculiarities of AtOgg1 which differs from the human homologue with respect to substrate specificity and interaction with other components of the repair machinery such as PCNAs.

In quanto organismi sessili e fotosintetici, le piante sono più esposte degli animali ad alti livelli di stress ossidativo causato da specie reattive dell'ossigeno (ROS) generate come risultato di stress bioitici, esposizione alla luce solare e attività metabolica. Uno dei principali danni ossidativi prodotti dai ROS è l'addotto 7,8-diidro-8-oxoguanina (8oxoG), una lesione altamente mutagenica che può portare a trasversioni GC -TA dovute a una sintesi errata da parte delle DNA polimerasi replicative. E' comunque possibile evitare l'insorgere di mutazioni tramite un meccanismo di sintesi translesione operato da DNA polimerasi specializzate in coordinazione con proteine ausiliare come l'Antigene Nucleare di Proliferazione Cellulare (PCNA). In A. thaliana l'unico membro della famiglia X delle DNA polimerasi riparative è la DNA polimerasi lambda. Inoltre, al contrario dell'uomo, A. thaliana possiede due geni codificanti per PCNA. E' stato dimostrato che la DNA polimerasi lambda interagisce con AtPCNA2 in un meccanismo di sintesi translesione per 8oxoG attivo in A. thaliana. E' anche ben risaputo che negli eucarioti la riparazione delle lesioni 8oxoG è condotta tramite un meccanismo di riparazione per escissione di basi (BER) iniziato da DNA glicosilasi. Lo scopo di questo lavoro è la caratterizzazione funzionale della 8oxoG DNA N-glicosilasi 1 (AtOgg1) e dell'Omologo di MutY (MutYH), due DNA glicosilasi responsabili dell'attivazione del BER per 8oxoG in A. thaliana. Sono state quindi ottenute le corrispondenti proteine ricombinanti tramite l'espressione in Escherichia coli dei rispettivi geni risintetizzati. Per quanto riguarda AtOgg1, la proteina risultante è stata purificata tramite cromatografia di affinità e in seguito analizzata in saggi di attività glicosilasica in vitro utilizzando diversi substrati sintetici radio-marcati. Risultati preliminari hanno evidenziato interessanti caratteristiche peculiari di AtOgg1, che differisce dall'omologo umano rispetto alla specifità di substrato e alle interazioni con altri componenti del macchinario riparativo come le PCNA.