Gene Editing in Retinal Photoreceptors (Modifica genica in Fotorecettori Retinici)

The aim of the study is to explore the prospect of an early intervention in the progenitors of rod photoreceptor cells, in order to prevent their death. For this purpose, has been selected the rd10 mouse model, which carries a point mutation in a gene linked with human Retinitis Pigmentosa. We designed a CRISPR-Cas9 gene editing system to repair the mutation, taking advantage of the increased activity of the homologous directed repair mechanism in dividing cells (progenitors). We tested the efficiency of electroporation in a mouse model of retinal degeneration (rd10). The rd10 mouse strain carries a spontaneous missense point mutation (one of most prevalent mutations associated with Retinitis Pigmentosa in humans) in the gene that encodes for the subunit beta of the enzyme Rod Phosphodiesterase (Pde6b), which is essential in the phototransduction cascade. The mice lacking this enzyme do not metabolise cGMP, and this enzymatic step is essential to close the cation channels in the photoreceptors membrane and trigger the hyperpolarization that starts the visual process. Our gene therapy employs the gene editing system CRISPR-Cas9 in association with a repair template. Thanks to the activation of the internal homology direct repair mechanism of the cells (active during dividing cycles), it is possible to correct the mutation directly in the progenitors of the photoreceptors. This correction is made before the onset of the degeneration. We measured the ability of CRISPR-Cas9 treated mice to see a flash light through a dark environment and their visual acuity with electrophysiological and behavioural tests.

Lo scopo dello studio è di esplorare una possibile metodologia di intervento precoce sui progenitori dei fotorecettori per prevenirne la degenerazione. Per questo motivo è stato selezionato il modello murino Rd10 che porta la mutazione di un gene connesso alla Retinite Pigmentosa nell’uomo. Abbiamo creato un sistema di modificazione genica CRISPR-Cas9 per riparare la mutazione ed utilizzato l’elettroporazione per permettere al sistema di penetrare nei fotorecettori. Il modello rd10 ha una mutazione puntiforme (una delle più comuni associata alla Retinite Pigmentosa) nel gene che codifica per l’enzima Fotodiesterasi (Pde6b) dei bastoncelli che è essenziale per la cascata fototrasduzionale. I topi, in mancanza di questo enzima, non metabolizzano cGMP che è essenziale per chiudere i canali ionici e cominciare l’iperpolarizzazione alla base del processo visivo. La terapia genica utilizzata impiaga un sistema di modificazione genetica CRISPR-Cas9 associato ad un modello di riparazione che agisce su meccanismi cellulari attivi durante la divisione cellulare, in questo modo è possibile correggere la mutazione direttamente nei progenitori dei fotorecettori. La correzione, quindi, avviene prima dell’inizio della degenerazione. Abbiamo misurato la capacità dei topi trattati con CRISPR-Cas9 a riconoscere flash luminosi in ambienti privi di luce e la loro acuità visiva con test elettrofisiologici e comportamentali.