This work consisted in the development of bioreactors based on nucleoside 2'-deoxyribosyltransferases and nucleoside phosphorylases for the in-flow synthesis of nucleoside analogues of pharmaceutical interest. The first bioreactor was prepared immobilizing nucleoside 2'-deoxyribosyltransferase from Lactobacillus reuteri (LrNDT) on Chromolith® Flash WP 300 epoxy silica monolithic column and the second was obtained by the co-immobilization of uridine phosphorylase from Clostridium perfringens (CpUP) and purine nucleoside phosphorylase from Aeromonas hydrophila (AhPNP) on Chromolith® Flash aminopropyl silica monolithic column. The comparison and the characterization of bioreactors allowed to evaluate which of the two was the best alternative to traditional organic methods for the synthesis of nucleoside analogues of pharmaceutical interest. On both bioreactors a covalent immobilization procedure was performed of enzymes and immobilization yields were calculated by the Bradford assay: 30 % for LrNDT (amount of immobilized enzyme: 1.0 mg), 34 % for CpUP/AhPNP (amount of immobilized enzyme: 6.8 mg). Enzymatic activity was defined by specific reactions. The activity of the bioreactors was evaluated by a common reaction. The in-flow synthesis of selected nucleoside analogues of pharmaceutical interest were then performed exploiting both IMERs. The nucleoside analogues of pharmaceutical interest were: 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdUrd), 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FdUrd) and 2',3'-dideoxyinosine (ddIno). The identity of the reaction products was verified using analytical standards and LC-MS/MS analyses. In this study different impurities/degradation products were observed in the reactions to produce 2'-deoxyadenosine (dAdo), IdUrd and FdUrd, especially using LrNDT-IMER. The concurrent reduction of peaks corresponding to Ade and dAdo suggested that impurities derive from their degradation. In order to prove this hypothesis, dAdo was continuously flowed in LrNDT-IMER and in a union (recirculation mode). The recirculation of dAdo in LrNDT-IMER confirmed that the impurities derive from dAdo degradation/modification. Instead, the recirculation in a union (employed instead of the IMER) confirmed that the formation of impurities is caused by the action of the enzyme on dAdo and not by thermal degradation. In the reaction to produce 2',3'-dideoxyinosine, two impurities were observed only using LrNDT-IMER. The peaks corresponding to these compounds grew over time in parallel to the product, suggesting that they are related to ddIno. This hypothesis was confirmed by LC-MS/MS analyses. In addition, a study to increase the reaction yields was performed using the selected bioreactor, LrNDT-IMER and employing 2'-deoxyuridine as sugar donor instead of dAdo. This study resulted in greater reaction yields and the impurities/degradation products were not observed. In conclusion, LrNDT-IMER, has been tested as a prototype for biosynthetic purposes through the IdUrd purification. 2.3 mg of IdUrd were purified. Therefore, LrNDT-IMER is an alternative to traditional organic methods for the synthesis of nucleoside analogues of pharmaceutical interest.
Il presente lavoro di tesi ha visto lo sviluppo di bioreattori a base di nucleoside 2'- desossiribosiltransferasi e nucleoside fosforilasi per la sintesi in flusso di analoghi nucleosidici di interesse farmaceutico. Un bioreattore è stato ottenuto immobilizzando la nucleoside 2'-desossiribosiltransferasi da Lactobacillus reuteri (LrNDT) su silice monolitica Chromolith® Flash WP 300 funzionalizzata con gruppi epossidici, mentre l’altro co-immobilizzando l’uridina fosforilasi da Clostridium perfringens (CpUP) e la purina nucleoside fosforilasi da Aeromonas hydrophila (AhPNP) su silice monolitica Chromolith® Flash funzionalizzata con gruppi amminopropilici e attivata con glutaraldeide. Attraverso il confronto e la caratterizzazione dei bioreattori è stato valutato quale tra i due fosse l’alternativa più adatta ai tradizionali metodi organici per la sintesi di analoghi nucleosidici di interesse farmaceutico. Su entrambi i bioreattori è stata eseguita una procedura di immobilizzazione covalente degli enzimi e dai dati ottenuti mediante il saggio di Bradford è stato possibile calcolare la percentuale di immobilizzazione che è risultata per LrNDT del 30% (quantità di enzima immobilizzato ≈ 1.0 mg), mentre per CpUP/AhPNP del 34% (quantità di enzimi immobilizzati ≈ 6.8 mg). Per valutare l’attività degli enzimi immobilizzati sono state condotte reazioni specifiche per ciascuno di essi. L’attività dei bioreattori è stata valutata mediante una comune reazione, che consisteva nel ricircolo di una soluzione substrato contente 2'-desossiuridina e adenina attraverso i bioreattori e la formazione di 2'-desossiadenosina (dAdo) e uracile. Dopo aver valutato le attività sono state condotte in flusso le sintesi dei nucleosidi di interesse farmaceutico: 5-iodio-2'-desossiuridina (IdUrd), 5-fluoro-2'-desossiuridina (FdUrd) e 2',3'-didesossinosina (ddIno). Per verificare l’identità dei prodotti di reazione sono state effettuate analisi LC-UV e LC-MS/MS. Dal monitoraggio delle reazioni sono state/i osservate/i diverse/i impurezze di reazione/prodotti di degradazione. Per individuare le loro origini sono stati condotti opportuni studi mediante metodi cromatografici o analisi LC-MS/MS. Lo studio delle/dei impurezze di reazione/prodotti di degradazione osservate/i nelle reazioni per la sintesi di dAdo, IdUrd e FdUrd, specialmente durante l’uso di LrNDT-IMER (Immobilized Enzyme Reactor), è stato condotto con il ricircolo di dAdo attraverso LrNDT-IMER che ha dimostrato che le/i impurezze/prodotti di degradazione derivavano dalla degradazione o modificazione di dAdo. Inoltre, per dimostrare che le/i impurezze di reazione/prodotti di degradazione fossero causate/i dall’azione dell’enzima su dAdo e non da una degradazione termica è stato condotto il ricircolo di dAdo nel sistema privo di bioreattore, quindi senza enzima immobilizzato. Nella reazione per la produzione di 2'-3'-didesossinosina, sono state osservate/i due impurezze/prodotti di degradazione usando LrNDT-IMER, i loro picchi crescevano nel tempo in parallelo alla formazione del prodotto ddIno. Per mezzo delle analisi LC-MS/MS si è dimostrato che le/i impurezze/prodotti di degradazione erano legate a ddIno. Inoltre, è stato condotto uno studio per l’aumento delle rese di reazione impiegando il bioreattore selezionato, LrNDT-IMER e utilizzando come nucleoside pirimidinico donatore del 2'-desossiribosio la 2'-desossiuridina al posto di dAdo. Questo studio si è concluso con un aumento delle rese di reazione e le/i impurezze di reazione/prodotti di degradazione non sono state/i osservate/i. In conclusione, LrNDT-IMER, attraverso la purificazione di IdUrd è stato testato come prototipo per scopi biosintetici. Sono stati purificati 2.3 mg di IdUrd, quindi LrNDT-IMER si è dimostrato una potenziale alternativa ai tradizionali metodi organici per la sintesi di analoghi nucleosidici di interesse farmaceutico.
Sviluppo di bioreattori a base di nucleoside 2'-desossiribosiltransferasi e nucleoside fosforilasi per la sintesi in flusso di analoghi nucleosidici di interesse farmaceutico
RAVA, SILVIA
2018/2019
Abstract
This work consisted in the development of bioreactors based on nucleoside 2'-deoxyribosyltransferases and nucleoside phosphorylases for the in-flow synthesis of nucleoside analogues of pharmaceutical interest. The first bioreactor was prepared immobilizing nucleoside 2'-deoxyribosyltransferase from Lactobacillus reuteri (LrNDT) on Chromolith® Flash WP 300 epoxy silica monolithic column and the second was obtained by the co-immobilization of uridine phosphorylase from Clostridium perfringens (CpUP) and purine nucleoside phosphorylase from Aeromonas hydrophila (AhPNP) on Chromolith® Flash aminopropyl silica monolithic column. The comparison and the characterization of bioreactors allowed to evaluate which of the two was the best alternative to traditional organic methods for the synthesis of nucleoside analogues of pharmaceutical interest. On both bioreactors a covalent immobilization procedure was performed of enzymes and immobilization yields were calculated by the Bradford assay: 30 % for LrNDT (amount of immobilized enzyme: 1.0 mg), 34 % for CpUP/AhPNP (amount of immobilized enzyme: 6.8 mg). Enzymatic activity was defined by specific reactions. The activity of the bioreactors was evaluated by a common reaction. The in-flow synthesis of selected nucleoside analogues of pharmaceutical interest were then performed exploiting both IMERs. The nucleoside analogues of pharmaceutical interest were: 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdUrd), 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FdUrd) and 2',3'-dideoxyinosine (ddIno). The identity of the reaction products was verified using analytical standards and LC-MS/MS analyses. In this study different impurities/degradation products were observed in the reactions to produce 2'-deoxyadenosine (dAdo), IdUrd and FdUrd, especially using LrNDT-IMER. The concurrent reduction of peaks corresponding to Ade and dAdo suggested that impurities derive from their degradation. In order to prove this hypothesis, dAdo was continuously flowed in LrNDT-IMER and in a union (recirculation mode). The recirculation of dAdo in LrNDT-IMER confirmed that the impurities derive from dAdo degradation/modification. Instead, the recirculation in a union (employed instead of the IMER) confirmed that the formation of impurities is caused by the action of the enzyme on dAdo and not by thermal degradation. In the reaction to produce 2',3'-dideoxyinosine, two impurities were observed only using LrNDT-IMER. The peaks corresponding to these compounds grew over time in parallel to the product, suggesting that they are related to ddIno. This hypothesis was confirmed by LC-MS/MS analyses. In addition, a study to increase the reaction yields was performed using the selected bioreactor, LrNDT-IMER and employing 2'-deoxyuridine as sugar donor instead of dAdo. This study resulted in greater reaction yields and the impurities/degradation products were not observed. In conclusion, LrNDT-IMER, has been tested as a prototype for biosynthetic purposes through the IdUrd purification. 2.3 mg of IdUrd were purified. Therefore, LrNDT-IMER is an alternative to traditional organic methods for the synthesis of nucleoside analogues of pharmaceutical interest.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/18940