CELLULE NEURONALI UMANE QUALE NUOVO MODELLO IN VITRO PER LA VALUTAZIONE DELLA CITOTOSSICITÀ DELLA CIGUATOSSINA

Ciguatoxins-group (CTXs) are marine emerging toxins which pose risks to human health in Europe, due to i) climate changes, which may cause the appearance of harmful algal blooms and their toxins in water previously absent, and ii) increase in tourism to tropical areas where ciguatoxin is mainly present. CTXs are potent fat-soluble compounds, produced by Gambierdiscus benthic microalgae, able to accumulate through the marine food chain. Ingestion of seafood containing the toxin may cause ciguatera poisoning in humans, a foodborne illness predominantly characterised by gastrointestinal and neurological disorders. The aim of this study was to assess in vitro CTX 3C toxicological profile, after 4 and 24 h exposure, through evaluation of two cellular endpoints: mitochondrial activity (MTT assay) and morphological contrast phase analysis. SH-SY5Y human neuroblastoma cells have been employed for this study as an alternative cell line compared to murine neuroblastoma Neuro-2a cells, the most widely used in vitro model to assess the CTX-induced cytotoxicity. It is known that CTXs are able to induce in vitro cytotoxic effect only in the co-presence of two compounds: Veratridine (V) and Ouabain (O). Starting from literature data indicating concentrations of O and V used to treat N2a cells, we had set up new optimal mix OV (10 nM Ouabain/25 μM Veratridine) for our human cellular model, as a basic requirement to induce cytotoxic effect of CTX. The results suggest that SH-SY5Y cells are more susceptible to Ouabain treatment than mouse N2a cells. In fact, differently from that observed for N2a cells which required higher concentration of Ouabain (500 μM), low concentration (10 nM) of Ouabain in the mix OV is sufficient to trigger a cytotoxic response in human neurons following exposure to CTX 3C. Moreover, the concentration of O (10 nM) used for the treatment of SH-SY5Y cells is closer to the ouabain levels measured in human plasma, as Endogenous Ouabain (EO). Subsequently, human neuroblastoma cells have been co-exposed to the mix OV and increasing concentrations of CTX 3C (0.005 -25 nM). Our results suggest that CTX 3C induces cytotoxic effect on human neuroblastoma SH-SY5Y cells starting from 100 pM. This human model could be used to detect submolar levels of ciguatoxin, like those found in fish and in human intoxicated tissues. Therefore, SH-SY5Y cells may represent a more realistic species-specific model suitable to characterize toxicological profile of ciguatoxins and other marine toxins.

Le ciguatossine (CTX) sono tossine marine emergenti che destano preoccupazione in Europa per la salute dei consumatori a causa dei cambiamenti climatici, i quali favoriscono la comparsa di fioriture algali nocive e delle loro tossine in acque prima assenti, e dell’aumento del turismo verso zone tropicali dove la ciguatossina è maggiormente presente. Le CTX sono potenti composti liposolubili, prodotti da microalghe bentoniche del genere Gambierdiscus, in grado di accumularsi lungo la catena alimentare. L’ingestione da parte dell’uomo di prodotti ittici contenenti queste tossine può provocare la ciguatera, un’intossicazione alimentare caratterizzata da sintomi prevalentemente gastrointestinali e neurologici. Lo scopo di questo elaborato di tesi è stato quello di caratterizzare la tossicità in vitro indotta dalla ciguatossina CTX 3C, dopo 4 e 24 ore di esposizione, attraverso due endpoint cellulari: valutazione dell’attività mitocondriale (MTT assay) e analisi morfologica (microscopia in contrasto di fase). Per lo studio sono state impiegate cellule di neuroblastoma di derivazione umana SH-SY5Y, come linea cellulare alternativa rispetto alle cellule di neuroblastoma murino Neuro-2a (N2a), ad oggi il modello maggiormente utilizzato in vitro per valutare la citotossicità indotta dalla CTX. È noto che, in vitro, l’effetto della ciguatossina si esplica solo in presenza di due composti: la Veratridina (V) e l’Ouabaina (O). A partire dai dati riportati in letteratura, relativi alle concentrazioni di O e V impiegate per le cellule N2a, abbiamo, dunque, individuato il mix OV ottimale (10 nM Ouabaina/25 μM Veratridina) per il nostro modello cellulare umano, quale requisito di base per indurre l’effetto citotossico della CTX. I risultati ottenuti indicano che le SH-SY5Y sono molto più sensibili all’Ouabaina rispetto alle cellule murine N2a. Infatti, per i neuroni umani è sufficiente una concentrazione di Ouabaina di 10 nM nel mix OV per innescare una risposta citotossica in seguito ad esposizione a CTX 3C, differentemente dai neuroni murini per i quali occorrono concentrazioni di Ouabaina decisamente più elevate (500 μM). Inoltre, la concentrazione di O (10 nM) scelta per il trattamento delle cellule SH-SY5Y si avvicina maggiormente ai livelli misurati nel plasma umano quale Ouabaina Endogena (EO). Successivamente, le cellule di neuroblastoma umano sono state co-esposte al mix OV individuato e a concentrazioni crescenti di CTX 3C (0.005-25 nM). Dai nostri risultati è emerso che l’effetto citotossico di CTX 3C, su cellule rappresentative di neuroni umani, si esplica a partire dalla concentrazione di 100 pM. Questo modello potrebbe, quindi, essere impiegato per rilevare bassi livelli (dell’ordine di grandezza submolare) di ciguatossina quali quelli riscontrati nei pesci e nei tessuti di individui intossicati. Le SH-SY5Y risultano, pertanto, un modello specie-specifico più realistico idoneo per caratterizzare il profilo tossicologico della ciguatossina e di altre tossine marine.