EFFETTO DEL TRATTAMENTO CON AMBROXOLO SULLA FUNZIONALITA’ LISOSOMIALE IN FIBROBLASTI DI PAZIENTI AFFETTI DA MALATTIA DI PARKINSON SPORADICA, CON E SENZA MUTAZIONE DEL GENE GBA1

Heterozygous mutations in GBA1 gene, encoding for lysosomal enzyme glucocerebrosidase (GCase), are a major risk factor for sporadic Parkinson's disease (PD). Defective GCase has been reported in fibroblasts of GBA1-mutant PD patients and pharmacological chaperone ambroxol has been shown to correct such defect. To further explore this issue,we investigated GCase and elements supporting GCase function and trafficking in fibroblasts fromsporadic PD patients — with or without heterozygous GBA1 mutations — and healthy subjects, in basal conditions and following in vitro exposure to ambroxol. We assessed protein levels of GCase, lysosomal integral membrane protein-2 (LIMP-2), which mediates GCase trafficking to lysosomes, GCase endogenous activator saposin (Sap) C and parkin, which is involved in degradation of defective GCase. We also measured activities of GCase and cathepsin D, which cleaves Sap C from precursor prosaposin. GCase activity was reduced in fibroblasts from GBA1-mutant patients and ambroxol corrected this defect. Ambroxol increased cathepsin D activity, GCase and Sap C protein levels in all groups, while LIMP-2 levels were increased only in GBA1-mutant PD fibroblasts. Parkin levels were slightly increased only in the PD group without GBA1 mutations and were not significantly modified by ambroxol. Our study confirms that GCase activity is deficient in fibroblasts of GBA1-mutant PD patients and that ambroxol corrects this defect. The drug increased Sap C and LIMP-2 protein levels, without interfering with parkin. These results confirm that chemical chaperone ambroxol modulates lysosomal markers, further highlighting targets that may be exploited for innovative PD therapeutic strategies.

Le mutazioni in eterozigosi del gene GBA1, che codifica per la glucocerebrosidasi lisosomiale (GCasi), rappresentano uno dei principali fattori di rischio per la malattia di Parkinson sporadica (MP). La GCasi difettosa è stata rilevata in fibroblasti di pazienti parkinsoniani con mutazioni in eterozigosi del gene GBA1 e l’ambroxolo è in grado di correggere tale difetto in qualità di chaperone molecolare. Per approfondire ulteriormente la questione sono stati analizzati la GCasi, gli elementi che sostengono la sua funzione e i fibroblasti di pazienti parkinsoniani con e senza mutazioni in GBA1 e soggetti sani, sia in condizioni basali che in seguito a trattamento in vitro con ambroxolo. Sono stati valutati i livelli proteici di GCasi, della proteina integrale di membrana lisosomiale di tipo 2 (LIMP-2), che favorisce il trasporto di GCasi ai lisosomi, di Saposina C (Sap C) e di parkina, coinvolta nella degradazione della GCasi difettosa. Sono stati inoltre valutati l’attività enzimatica di GCasi e della Catepsina D (CatD), che effettua il taglio su prosaposina (PSAP), precursore di Sap C. L’attività enzimatica di GCasi risulta essere ridotta in fibroblasti prelevati dai pazienti con mutazioni in GBA1 e ambroxolo riesce a correggere questo difetto. Ambroxolo incrementa anche l'attività di CatD, di GCasi e dei livelli proteici di Sap C in tutti i gruppi, mentre i livelli di LIMP-2 aumentano solo in fibroblasti di pazienti parkinsoniani con mutazioni in GBA1. I livelli proteici di parkina sono leggermente aumentati solo nel gruppo di fibroblasti prelevati da pazienti parkinsoniani senza mutazioni in GBA1 e non si sono avute modificazioni significative in seguito al trattamento con ambroxolo. Questo studio conferma che l'attività di GCasi è carente in fibroblasti di pazienti parkinsoniani con mutazioni in GBA1 e che ambroxolo corregge questo difetto. Il farmaco dunque aumenta i livelli proteici di Sap C e LIMP-2, senza interferire con parkina. I risultati infine dimostrano che ambroxolo riesce a modulare i marcatori lisosomiali, ponendo così un accento sugli obiettivi che possono essere raggiunti con le strategie terapeutiche innovative per la MP.