Genome Editing in Medicago truncatula: Ottimizzazione di un protocollo di trasformazione su cellule in sospensione tramite sistema CRISPR-Cas

CRISPR-Cas is a recently developed genetic engineering tool. Its use in both basic and applied research could bring important innovations in numerous fields. The specific use of this technique permits to do induced targeted modifications in the genome of an organism in a rapid and effective manner. The objective of this thesis is to optimize a transformation protocol for Medicago truncatula cell suspension. The method of choice is the Agrobacterium tumefaciens mediated transformation with a plasmid containing the gene cassette for Cas9 fused with the Green Fluorescence Protein (GFP) and for the expression of the single guided RNA. The expression of sgRNA-Cas9 permits to silence the Tyrosil-DNA phosphodiesterase 1 β (TDP1β) gene by cutting the nucleotide sequence upstream its main catalytic domain. The TDP1β gene encodes of an enzyme involved in the DNA repair pathway. A bioinformatics analysis was carried out on TDP1α and TDP1β sequences to identify better sgRNAs. The cloning of the CRISPR-Cas construct was performed by using the Gibson Assembly method. The protocol for the A. tumefaciens – mediated transformation was optimized to be used for Medicago truncatula cell suspension. To do so, the cell suspension was co-cultivated with A tumefaciens transformed with the designed plasmid. The optimizations consisted mainly in adjustingt the co-cultivation time, bacterial concentration, and methods, to subsequently remove the bacteria and confirm the transformation.

CRISPR-Cas è un sistema di ingegneria genetica recente e in continuo sviluppo, il cui utilizzo nella ricerca di base e applicata può portare a importanti innovazioni in numerosi ambiti. Nello specifico l’utilizzo di questa tecnica permette di eseguire modifiche mirate nel genoma di un organismo in un modo rapido ed efficace. L’obiettivo di questa tesi consiste nell’ottimizzazione di un protocollo di trasformazione di cellule in sospensione della leguminosa modello Medicago truncatula tramite co-coltivazione con Agrobacterium tumefaciens contenente un costrutto sgRNA-Cas9. L’espressione del costrutto sgRNA-Cas9 nella pianta permetterebbe di silenziare il gene tyrosil-DNA-fosfodiesterasi 1 β (TDP1β) attraverso un taglio nella sequenza nucleotidica posta a monte di uno dei siti catalitici dell’enzima. Il gene TDP1β codifica per un enzima coinvolto nei meccanismi di riparo ai danni al DNA. Nello specifico, è stata eseguita un’analisi bioinformatica delle sequenze nucleotidiche e amminoacidiche delle proteine TDP1α e TDP1β per identificare la sequenza target (sgRNA) ideale per procedere con il clonaggio del plasmide tramite metodo Gibson. Ulteriormente, è stato ottimizzato un protocollo trasformazione di cellule in sospensione di Medicago truncatula tramite Agrobacterium tumefaciens trasformato con il plasmide pK7WGF2::hCas9 contenente la cassetta codificante hCas9. L’ottimizzazione ha riguardato principalmente l’aggiustamento di tempo di co-coltivazione, concentrazione batterica e scelta dei metodi migliori per rimuovere i batteri e confermare la trasformazione.