Elaborazione di scaffolds biciclolattamici per la coniugazione di composti bioattivi: studi preliminari

Integrins are the most important class of transmembrane receptors involved in cellular adhesion processes and in the interaction with protein of the extracellular matrix (ECM). These receptors are heterodimeric glycoproteins composed of an α and a β subunit. Currently 18 types of α and 8 types of β subunit are known and they may combine forming 24 different integrin receptors. Because of their overexpression in many types of tumors and in neoangiogenic endothelial cells, integrins αvβ3 and αvβ5 represent an interesting target for the development of novel antitumor active principles, imaging techniques and drug delivery. αvβ3 and αvβ5 antagonists, containing the Arg-Gly-Asp (RGD) recognition motif, showed high selectivity towards their target, low toxicity and a considerable antiangiogenic and antiproliferative action. In order to obtain more potent bioactive compounds and to reduce side effects of known cytotoxic drugs, recent studies focalized on the synthesis of bioconjugates which exploit the selectivity of the integrin antagonist for its biological target. This thesis’ work is part of a wider project aiming at the development and optimization of a synthetic route in order to obtain a bicyclic lactam scaffold, to which the Arg-Gly-Asp (RGD) recognition motif will be bound, characterized by the presence of a functionalization site for successive bioconjugation . A scaffold is the molecular structure that keeps in the correct spatial orientation the pharmacophoric elements, thus it is mandatory for the maintenance of the RGD peptide chain in an optimal conformation for a proper interaction with the biological target. The aim of this project is to elaborate an innovative synthetic protocol in order to obtain the scaffold with higher yields and less work time compared to the previously developed synthetic routes. The development and optimization of the key reaction: a “domino cross-enyne metathesis/ring-closing metathesis” (domino CEYM/RCM), occupied most of the time spent during my internship. By exploiting this reaction, we were able to introduce an alchenylarylamidic chain on the seven membered ring of the bicycle lactam which acts as organic spacer and at the same time as coupling point for the bioconjugation. This operation allowed us to save a considerable amount of time and expenses compared to the previous procedures. Infact we were able to obtain in a single step the scaffold modified with the alkenylarylamidic chain with satisfactory yields, between 50-55%. After the reduction of the double bonds, deprotection of the Fmoc (9-fluorenyl-methoxycarbonyl) moiety and protection with Cbz (benzyloxycarbonyl), a direct functionalization of the scaffold with the RGD sequence and successive bioconjugation may be pursued.

Le integrine sono la più importante classe di recettori transmembranali coinvolti nei processi di adesione cellulare e di interazione con le proteine della matrice extracellulare (ECM). Questi recettori sono glicoproteine eterodimeriche composte da una subunità α ed una β. Al momento sono noti 18 tipi di subunità α e 8 di subunità β che possono combinarsi formando 24 diversi recettori integrinici. In particolare le integrine αvβ3 e αvβ5, essendo sovraespresse in molti tipi di tumori e sulle cellule endoteliali dei vasi neoangiogenici, rappresentano un target di primario interesse nell’ambito della terapia antitumorale, dell’imaging e del drug delivery. Gli inibitori delle integrine αvβ3 e αvβ5, recanti la sequenza di riconoscimento Arg-Gly-Asp (RGD), hanno mostrato elevata selettività nei confronti del target recettoriale, scarsa tossicità e una rilevante azione antiangiogenica e antiproliferativa. Al fine di ottenere principi attivi più potenti e ridurre gli effetti collaterali di farmaci citotossici noti, i recenti studi si stanno focalizzando sulla sintesi di bioconiugati che sfruttino la selettività dell’antagonista integrinico per il suo target biologico. Questo lavoro di tesi si inserisce all’interno di un progetto più ampio finalizzato alla messa a punto e all’ottimizzazione di una via di sintesi che porti all’ottenimento di uno scaffold a struttura biciclolattamica, a cui legare la sequenza di riconoscimento RGD, caratterizzato da un ulteriore sito di funzionalizzazione sfruttabile per la bioconiugazione. Lo scaffold (in nero) è la struttura molecolare che permette il corretto posizionamento spaziale degli elementi farmacoforici, esso è indispensabile per il mantenimento della sequenza RGD nella conformazione corretta ai fini dell’interazione con il target biologico. Lo scopo di questo progetto è l'elaborazione di un'innovativa via sintetica che porti all'ottenimento dello scaffold prefissato in minor tempo e con rese maggiori rispetto alle vie di sintesi precedentemente sviluppate nel nostro laboratorio. Buona parte della mia attività si è focalizzata sulla messa a punto e sull'ottimizzazione della reazione chiave: una "domino cross-enyne metathesis/ring-closing metathesis" (domino CEYM/RCM). Sfruttando questa reazione siamo riusciti a introdurre direttamente sull’anello a 7 termini del sistema biciclolattamico una porzione alchenilarilammidica in grado di svolgere contemporaneamente le funzioni di spaziatore organico e punto di aggancio per un eventuale composto bioattivo. Tale operazione è stata portata a termine con notevole risparmio di tempo e costi rispetto alle metodiche precedentemente sperimentate, infatti siamo riusciti ad ottenere in un singolo passaggio lo scaffold modificato con la catena alchenilarilammidica con rese comprese nell’intervallo 50-55%. In seguito a successiva riduzione dei doppi legami coniugati, deprotezione del gruppo protettivo Fmoc (9-fluorenil-metossicarbonil) e protezione con Cbz (benzilossicarbonil) sarà quindi possibile procedere all’aggancio della sequenza RGD e alla successiva bioconiugazione.