Proteomic and bioinformatics analysis of lymphoblastoid cells from patients with Nasu-Hakola disease

Nasu-Hakola Disease (NHD), also known as Polycystic Lipomembranous Osteodysplasia with Sclerosing Leukoencephalopathy (PLOSL), is a very rare autosomal recessive syndrome characterized by a combination of frontotemporal pre-senile dementia associated with recurrent bone fractures due to polycystic osseous lesions of the lower and upper extremities. NHD is genetically related to a structural defect of TREM2 and DAP12 genes that encode for different subunits of the membrane receptor signaling complex expressed by microglia and osteoclast cells. Unfortunately, nowadays, diagnosing this pathology is not an easy task and no curative treatment is still available. Therefore, aim of this research was to identify one or more molecules that can act as potential biomarkers of the disorder, to differentiate it from other neurodegenerative syndromes, such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease. My lab’s colleagues had performed, previously, a proteomic analysis using a technique that is based on obtaining a proteomic profile by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). Although it has produced interesting information, they were insufficient because of the intrinsic limitation of the technique. It shows problems related to the separation of big amount of proteins, proteins with high molecular weight and/or with extreme values of isoelectric point. In order to overcome these limitations and achieve more detailed information, a gel-free proteomic approach, based on MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology), was applied for the analysis of the whole protein extract. It allowed to identify about 3000 distinct proteins, some of which have already been studied, some others, instead, require a more detailed analysis to know their function. The use of bioinformatic tools, allowed me to identify a number of proteins differentially expressed among patients (Ho,He and Wt), three of which (RAC1, PLCG2 and VAV2), involved in the osteoclast pathway, have been also validated by western blotting analysis. The possibility that these proteins are good biomarkers is still an aspect to prove further, however this represents the step forward on this disease that could be more widespread than it is believed.

La malattia di Nasu-Hakola (NHD), nota anche come osteodisplasia lipomembranosa policistica con leucoencefalopatia sclerosante (PLOSL), è una rara sindrome autosomica recessiva caratterizzata da demenza presenile frontotemporale associata a fratture ossee causate dalla presenza di cisti a livello degli arti superiori e inferiori. Le basi genetiche che determinano la patologia sono correlate ad un difetto strutturale di due geni, TREM2 e DAP12, che codificano per due subunità del recettore transmembrana di un complesso di segnalazione espresso dalle cellule della microglia e dagli osteoclasti. Purtroppo, ad oggi, non vi sono cure disponibili e anche la diagnosi risulta essere un complito particolarmente complesso. Pertanto, lo scopo di questo lavoro è stato quello di identificare una o più molecole che possano agire come potenziali biomarcatori per poter differenziare questa malattia dalle più comuni patologie neurodegenerative come l’Alzheimer e il Parkinson. I colleghi, che mi hanno preceduto nel laboratorio dove ho svolto il mio lavoro di tesi, avevano effettuato ricerche di proteomica su questa malattia utilizzando una metodica che si basa sull’ottenimento del profilo proteomico mediante elettroforesi su gel in due dimensioni (2-DE). Pur avendo prodotto informazioni di un certo interesse, questi erano insufficienti a causa delle intrinseche limitazioni della tecnica che non è in grado di separare grandi quantità di proteine e proteine che presentano un elevato peso molecolare e/o che hanno valori estremi di punto isoelettrico. Con l’obiettivo di superare questi limiti ed avere informazioni più dettagliate, si è passati all’utilizzo di una metodica gel-free basata sulla MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology) che si avvale della combinazione di micro-cromatografia liquida bidimensionale e spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione. Tale tecnica mi ha permesso di indentificare circa 3000 proteine, alcune delle quali sono state studiate, altre invece sono ancora da analizzare per capire quale possa essere la loro funzione. Servendomi di differenti tecniche bioinformatiche, volte a permettermi di comprendere quali fossero le loro funzioni e i possibili network tra di loro, ho potuto identificare un numero di proteine che presentano un diverso livello di espressione nelle tre categorie di soggetti analizzati, Ho, He e Wt; inoltre tra queste, tre proteine (RAC1, PLCG2 and VAV2) sono risultate essere coinvolte nel pathway degli osteoclasti. Il fatto che queste proteine siano effettivamente dei buoni biomarcatori è ancora un aspetto da dimostrare ulteriormente tuttavia questo mi sembra il primo passo per andare avanti nello studio in questa malattia che potrebbe essere più diffusa di quanto non si creda.