Applicazione della tecnica MLPA per la diagnosi molecolare dell'Albinismo Oculocutaneo e degli Angiomi Cavernosi Cerebrali Familiari

MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) is a technique that allow detecting abnormal copy number of genomic sequences, like duplications or deletions of one or more exons of many genes, not revealed by direct sequencing. It is a multiplex PCR reaction where MLPA probes, which hybridise to the target sequences, are amplified by the use of single pair PCR universal primers (FORWARD/REVERSE). This method was used for the molecular diagnosis of two diseases: Oculocutaneous Albinism, an autosomal recessive disorder, and Familial Cerebral Cavernous Malformations (FCCM), an autosomal dominant disorder. The purpose of my thesis is to demonstrate how the same method must be adapted to a specific disease, according to the genes involved, in order to obtain complete results for a correct molecular diagnosis. The TYR and OCA2 genes were analyzed for the molecular analysis of Oculocutaneous Albinism, while the KRIT1, MGC4607 and PDCD10 genes were analyzed for the molecular analysis of FCCM. Both analyses were carried out by MLPA assay. The general MLPA protocol was used as a starting point, but it underwent some changes. Finally, after many trials, the experimental conditions were modified and optimized and all changes made showed us that a different methodological approach has to use according to disease analyzed. MLPA was used to analyze: - A cohort of 50 patients affected by Oculocutaneous Albinism who resulted negative for direct sequencing of TYR, OCA2 e OCA4 genes or they were heterozygous for a mutation in either TYR or OCA2 gene. Approximately, 14% of them resulted MLPA positive: 10% of them had TYR gene deletions and 4% of them had OCA2 gene deletions. However, MLPA assay was inconclusive for a significant percentage of the patients because this method can be used to analyze only TYR and OCA2 genes. So, is not possible to detect genomic rearrangements of other genes that cause this genetic disorder (TYRP1, SLC45A2, SLC24A5 e C10orf11); - A cohort of 50 patients affected by FCCM who resulted negative for direct sequencing of KRIT1, MGC4607 and PDCD10 genes that cause this genetic disorder. Approximately, 26% of them resulted MLPA positive and KRIT1 was the gene more frequently deleted. MLPA assay was conclusive for FCCM, although there were many patients who resulted MLPA negative. Therefore, we supposed that there might be a fourth gene that has not been identified yet or there might be any regulatory sequences, not analyzed, that could be correlated with disease.

L’MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) è una tecnica che permette di rilevare un cambiamento nel numero di copie di una determinata sequenza genomica, come un’inserzione o una delezione di uno o più esoni di geni noti, non identificabili tramite sequenziamento diretto. Si tratta di una reazione di PCR in cui, attraverso l’utilizzo di una sola coppia di primer universali (FORWARD/REVERSE), vengono amplificate le sonde complementari alle sequenze target specifiche. Questa tecnica è stata utilizzata per eseguire la diagnosi molecolare dell’Albinismo Oculocutaneo, a trasmissione autosomica recessiva, e degli Angiomi Cavernosi Cerebrali di tipo familiare (FCCM), a trasmissione autosomica dominante. Il lavoro di tesi vuole dimostrare come una stessa metodica debba essere adattata alla patologia e, quindi, ai geni che si vogliono analizzare, con lo scopo di ottenere dei risultati precisi ed esaustivi. Nel mio caso, sono stati analizzati i geni TYR e OCA2 per l’Albinismo Oculocutaneo e i geni KRIT1, MGC4607 e PDCD10 per gli FCCM. Perciò, partendo dal protocollo sperimentale allegato ai kit MLPA, dopo diverse prove, le condizioni sperimentali standard sono state modificate e, quindi, ottimizzate in base al contesto. Di conseguenza, tutto ciò ha messo in luce delle differenze di approccio metodologico, importanti per la corretta diagnosi molecolare delle due patologie. Mediante MLPA sono stati analizzati: - Una coorte di 50 pazienti affetti da Albinismo Oculocutaneo e risultati negativi all’analisi dei geni TYR, OCA2 e OCA4 o eterozigoti per una mutazione sui geni TYR o OCA2. Da questa analisi, circa il 14% dei pazienti è risultato MLPA-positivo di cui, il 10% presenta delezioni a carico del gene TYR e il 4% presenta delezioni a carico del gene OCA2. Tuttavia, una grossa percentuale rimane irrisolta dall’MLPA poiché questo tipo di analisi è rivolto solo ai geni TYR e OCA2 per cui non è possibile rilevare la presenza di eventuali riarrangiamenti sugli altri geni causativi della patologia (TYRP1, SLC45A2, SLC24A5 e C10orf11); - Una coorte di 50 pazienti affetti da Angiomi Cavernosi Cerebrali di tipo familiare risultati negativi al sequenziamento diretto dei geni KRIT1, MGC4607, PDCD10, ad oggi considerati causativi della patologia. Dall’analisi è scaturito che il 24% dei pazienti è MLPA-positivo e che il gene deleto con maggiore frequenza è KRIT1. Per questa patologia l’MLPA può considerarsi conclusiva anche se, buona parte dei soggetti in esame, sono risultati MLPA-negativi. Questo fa ipotizzare o la presenza di un quarto gene causativo ancora non identificato o la correlazione della patologia a regioni di regolazione di espressione