Study of metabolism of S. clavuligerus: evaluation and modification of clavulanic acid fermentation parameters. (Studio del metabolismo di S. clavuligerus: valutazione e modifica dei parametri di fermentazione dell' acido clavulanico.)

Clavulanic acid is a product of the secondary metabolism of Streptomyces clavuligerus, a filamentous bacterium belonging to the order of Actinomycetes. Clavulanic acid is administered in combination with amoxicillin, as it is an inhibitor of β-lactamases responsible for resistance to β-lactam antibiotics. This work of thesis was carried out at the pharmaceutical company Sandoz IP in Rovereto (TN), where clavulanic acid is produced through the fed-batch aerobic fermentation of an engineered strain of Streptomyces clavuligerus. The actual fermentation is the last phase of a growth process, which begins in flasks. This is followed by the subsequent transfer of the culture broth into 3 bioreactors of increasing size: a pre-seed, a seed and a fermenter. The entire operation is controlled by monitoring input parameters such as the origin and composition of the materials that make up the soil, the inoculum conditions, pH, aeration and agitation. Microbial growth during each phase of the process is measured with output parameters such as pH, viscosity, oxygen consumption; in this thesis the aim is the introduction of a new control parameter which is the kinetic growth of the microorganism. The experiments were conducted in flask, which is the first step in the development of a model to achieve as output indicative data of the results potentially obtainable from scale-up in bioreactors. The kinetic trend was monitored in a standard fermentation medium and compared with that obtainable in media with modified nutrient concentrations. The objective is to find the concentration of limiting substrate that, in addition to allowing the increase of biomass, allows the production of the metabolite of interest. In the second part of the work the aim is to obtain a greater productivity of clavulanic acid following modifications made to a fermentative medium currently in use. In both tests, the concentrations of nutrient, such as carbon or nitrogen sources, were modified and the introduction of arginine as a free amino acid was proposed,as it is a precursor of clavulanic acid.

Lacido clavulanico è un prodotto del metabolismo secondario di Streptomyces clavuligerus, un batterio filamentoso appartenente allordine degli Attinomiceti. È somministrato in combinazione con lamoxicillina, in quanto è un inibitore delle β-lattamasi responsabili della resistenza agli antibiotici β-lattamici. Il lavoro di tesi è stato svolto presso lazienda farmaceutica Sandoz IP di Rovereto (TN), dove lacido clavulanico viene prodotto attraverso la fermentazione aerobia a fed-batch di un ceppo ingegnerizzato di Streptomyces clavuligerus. La fermentazione vera e propria è lultima fase di un processo di crescita, che ha inizio in beuta. Segue il trasferimento successivo del brodo di cultura in 3 bioreattori di crescenti dimensioni: un pre-seed, un seed e un fermentatore. Lintera operazione è controllata attraverso il monitoraggio di parametri di input quali lorigine e la composizione dei materiali che costituiscono il terreno, le condizioni dinoculo, il pH, laerazione e lagitazione. La crescita microbica durante ciascuna fase del processo è misurata con parametri di output quali il pH, la viscosità, il consumo di ossigeno; tra questi in tale lavoro di tesi si vuole introdurre un nuovo parametro di controllo, ovvero la cinetica di crescita del microorganismo. Gli esperimenti sono stati condotti in beuta, che è il primo step per lelaborazione di un modello per ottenere come output dati indicativi dei risultati potenzialmente ottenibili dallo scale-up nei bioreattori. Landamento della cinetica è stato monitorato in un terreno fermentativo standard e confrontato con quello ricavabile in terreni con concentrazioni di nutrienti modificate. Lobiettivo è trovare la concentrazione di substrato limitante che oltre a permettere laumento di biomassa, consenta la produzione del metabolita dinteresse. Nella seconda parte dellelaborato si vuole ottenere una maggiore produttività di acido clavulanico a seguito di modifiche apportate a un terreno fermentativo attualmente in uso. In entrambe le prove, sono state modificate le concentrazioni di nutrienti-fonti di carbonio o azoto- e/o si è proposta lintroduzione di arginina come amminoacido libero poiché essa è precursore dellacido clavulanico.