Time resolved fluorescence optical nanoscopy for multimodal live cell imaging

Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) is an optical technique that allows quantitative and qualitative characterization of the fluorescent components of a sample. This technique is also used for the analysis of complex biological systems, but the implementation with a global fitting algorithm, have been shown to improve effectively recording accuracy. In this work, the analysis of fluorescence decay, in terms of discrete exponential components, was necessary in order to provide a true representation of the fluorescence dynamics of the sample, using the microscope RESOLFT. FLIM associated with a new microscopy technique was used to probe cells and tissues, for biochemical and morphological changes associated with pathological conditions. Nowadays, we benefit of many types of microscopes such as optical nanoscopes with a maximum resolution of 50 nm or electronic microscopes able to observe atomic structures. In particular, the great power of the optical microscope comes from: • the possibility to observe a sample in vivo. This technique is the only one characterized by minimum invasion light for the imaging • ability to selectively look at a specific molecular structure of cell, using particular fluorescent protein as a marker for that structure of interest. This study aims to present the results of one of the most recent configurations of optical microscope and how it was used for a new technique of images recording. The analysis was conducted under the supervision of Prof. Ilaria Testa, group leader of the Advance Optical Bio-Imaging lab at SciLifeLab in Stockholm (Sweden).

Nanoscopia ottica a fluorescenza risolta nel tempo per immagini multimodali di cellule in vivo. Questo lavoro di tesi riguarda lo studio e la caratterizzazione delle cinetiche di accensione e spegnimento della fluorescenza, emessa da proteine controllabili otticamente rsFP (reversible switchable Fluorescent Proteins) in campioni biologici. L’attività è stata svolta durante il periodo di mobilità Erasmus Traineeship, presso il centro di ricerca SciLifeLab di Stoccolma, sotto la supervisione della Prof.ssa Ilaria Testa. Gli esperimenti sono stati svolti tramite l’utilizzo della tecnica di microscopia confocale e a super risoluzione RESOLFT (Reversible Saturable Optical Linear Fluorescence Transition). La RESOLFT consente di distinguere due caratteristiche di uno stesso campione situate ad una distanza compresa tra 80-50 nm, valori che con la convenzionale microscopia confocale non sarebbe possibile raggiungere, dal momento che il limite di diffrazione è circa di 200 nm. Il campione è illuminato con un laser di attivazione (405 nm), permettendo alla proteina di cambiare conformazione e diventare sensibile alla luce di lunghezze d’onda meno energetiche. Successivamente la medesima porzione è raggiunta da un fascio laser con lunghezza d’onda nel blue (488nm). Il fascio presenta, idealmente, un valore di intensità nel centro pari a zero con un diametro di circa 200 nm. In tale situazione il segnale di fluorescenza emessa dal campione sarà solo quella generata dalla porzione presente all’interno dello spot di intensità nulla. Un terzo laser (a 488 nm), è utilizzato in successione ai primi due per completare lo spegnimento del campione. Lo studio è stato svolto su campioni di cellule di osteosarcoma umano in vivo, marcate con proteine superfluorescenti con diffenti tempi di vita. Sono stati analizzati prima singolarmente per osservare il loro decadimento della fluorescenza in un lasso di tempo suddiviso in cinque intervalli temporali di uguale durata. Successivamente gli esperimenti sono stati ripetuti con campioni marcati con due differenti fluorofori che hanno consentito di marcare aree differenti. Lo scopo del lavoro è stato quello di acquisire delle immagini a super risoluzione e analizzarle per distinguere le due popolazioni di fluorofori nel campione. Con la tecnica di microscopia RESOLFT è stato quindi possibile osservare delle cellule marcate con rsEFGP2 con una risoluzione di 70-60 nm, come verrà ampliamente descritto nei capitoli successivi e dimostrato tramite alcune immagini acquisite durante lo studio Per il lavoro di imaging è stato necessario sviluppare un codice in Matlab,che ha permesso di osservare il nucleo e il citoscheletro delle cellule, marcate con diversi fluorofori. Il codice è riportato nell’Appendice III, mentre nei capitoli 5 e 6 sono presenti le immagini dell’interfaccia grafica che ho sviluppato, con i relativi risultati dello studio svolto.