Identificazione di batteri potenzialmente associati a Echinococcus granulosus, agente eziologico dell'echinococcosi cistica

Cystic echinococcosis (CE) is a parasitosis caused by the larval form of the cestode of the genus Echinococcus. CE is prevalent worldwide especially in rural livestock-raising areas, representing an endemic or an emerging/re-emerging disease. Dogs are the definitive hosts for this parasite, while the livestock are the normal intermediate hosts. Humans are occasional intermediate hosts in which the larval stage of E. granulosus develops as cysts, with a diameter that can reach 20 cm and more, over long periods of time (years). These cysts are mainly localized in the liver (70%) and in the lungs (20%), but they may develop in any organ or tissue. Over the years, various ultrasound classifications of hydatid cysts have been proposed. The most widely used was that of Gharbi (Gharbi H.A., et al., 1981) although in 2003 the World Health Organization (WHO) proposed an ultrasound classification that referred to the stage of cyst activity (WHO- IWGE; 2003). The classification proposed by WHO-IWGE is as follows: CE1, CE2 active cyst; CE3a and CE3b transitional cyst; CE4 and CE5 inactive cyst. CE is almost always asymptomatic at first, due to the slow growth of cysts, which take many years before reaching considerable dimensions that induce an important symptomatology. The intensity and nature of clinical manifestations also depend on the location of the cysts, their number and their evolution. Early diagnosis allows the best treatment of this pathology because according to the location, stage and size of cysts the choice of treatment varies. Drug treatment for echinococcosis relies on benzimidazoles such as albendazole, which are ineffective in 20-30% of cases, and have other limitations such as being only parasitostatic, which often implies life-long administration. In this rather depressing scenario, an interesting opening is represented by bacterial mutualism. In some parasitic diseases, such as filariosis, symbiotic bacteria have been used as therapeutic targets and their presence has been harnessed to develop new diagnostic tests. A relevant example of a bacterial–nematode mutualism occurs between the bacterial endosymbiont Wolbachia and filarial nematodes. The aim of this thesis is to investigate the presence of symbiotic bacteria in E. granulosus. Sixteen cyst samples from patients affected with CE and 34 cyst samples from naturally infected sheep were collected for this study. Cyst samples were taken from patients who underwent surgery or PAIR as treatment for their disease at the Policlinico San Matteo Hospital Foundation, Pavia. The gathering phase of the material for this thesis work has required many months because for the collection of human samples the material depends on the stage and the type of therapeutic approach chosen, while for the samples of animal origin depends on the incidence of the disease in the various herds and the slaughter period. After analysis by NGS in 15 samples it was found the presence of bacteria belonging to the genus Caulobacter, in 8 bacterial samples of the genus Brevundimonas and in the remaining 25, bacteria of the genus Flavobacterium. These preliminary results are a novelty in the area of Echinococcosis research. If should further work confirm that such bacteria are symbionts of E. granulosus or that bacteria play an immunological role in their coexistence with the host, novel research lines would be opened. Subjects such as anti-bacterial/anti-symbiont chemotherapy of CE and new aspects of CE immunology could be explored stemming from this discovery.

L'echinococcosi cistica (EC) è una parassitosi causata dalla forma larvale del cestode del genere Echinococcus. L'EC è diffusa in tutto il mondo, soprattutto nelle aree rurali in cui l’allevamento del bestiame è diffuso, rappresentando una malattia endemica o emergente/riemergente. I canidi sono l’ospite definitivo per questo parassita, mentre gli ovini sono l’ospite intermedio. L’uomo può diventare un ospite intermedio accidentale, in cui lo stadio larvale del parassita si sviluppa in cisti che possono raggiungere un diametro di 20 cm e oltre, per lunghi periodi di tempo (anni). Queste cisti sono localizzate soprattutto nel fegato (70%) e nei polmoni (20%), ma possono svilupparsi in ogni organo o tessuto. In base allo stadio della malattia l'aspetto delle cisti è variabile. Nel corso degli anni sono state proposte varie classificazioni ecografiche delle cisti idatidee, la più usata è stata quella di Gharbi (Gharbi H.A., et al., 1981), anche se nel 2003 l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) sull'echinococcosi ha proposto una classificazione ecografica che facesse riferimento allo stadio di attività della cisti (WHO-IWGE; 2003). La classificazione proposta dall' WHO-IWGE è la seguente: CE1, CE2 cisti attiva; CE3a e CE3b cisti transizionale; CE4 e CE5 cisti inattiva. L’EC è quasi sempre asintomatica inizialmente, fatto dovuto al lento accrescimento delle cisti, che impiegano molti anni prima di raggiungere dimensioni considerevoli tali da indurre una sintomatologia importante. L'intensità e la natura delle manifestazioni cliniche dipendono, inoltre, dalla localizzazione delle cisti, dal loro numero e dalla loro evoluzione. La diagnosi precoce permette il trattamento migliore di questa patologia in quanto a seconda della localizzazione, stadio e dimensione delle cisti la scelta del trattamento varia. Il trattamento farmacologico per l'echinococcosi si basa su benzimidazolici come albendazolo, che sono inefficaci nel 20-30% dei casi, e sono parassitostatici, il che implica trattamenti di lunga durata. In questo panorama piuttosto deprimente, un'interessante possibilità è rappresentata dal mutualismo batterico. In alcune malattie parassitarie, ad esempio nella filariosi, i batteri simbionti vengono utilizzati come bersagli terapeutici e la loro presenza viene sfruttata per lo sviluppo di nuovi test diagnostici. Un esempio rilevante di mutualismo batterio-nematode si verifica tra l'endosimbionte batterico Wolbachia e i nematodi filarie. Lo scopo di questa tesi è quello di ricercare la presenza di batteri simbionti in E. granulosus. Per questo studio sono stati raccolti 16 campioni di cisti da pazienti affetti da EC e 34 campioni di cisti da pecore infette. I pazienti hanno ricevuto un intervento chirurgico o PAIR come trattamento per la loro patologia presso la Fondazione IRCSS Policlinico San Matteo, Pavia. La fase di raccolta del materiale per questo lavoro di tesi ha richiesto molti mesi in quanto per quanto concerne i campioni umani, la raccolta del materiale dipende dallo stadio e dal tipo di approccio terapeutico scelto, mentre per quanto riguarda i campioni di origine animale dipende dall’incidenza della patologia nei vari allevamenti e dal periodo di macellazione. In seguito ad analisi mediante NGS in 15 campioni è stata riscontrata la presenza di batteri appartenenti al genere Caulobacter, in 8 campioni batteri del genere Brevundimonas e nei restati 25, batteri del genere Flavobacterium. Questi risultati preliminari potrebbero costituire un’autentica novità nel campo della ricerca sull’ EC. Se ulteriori lavori confermano che tali batteri sono simbionti di E. granulosus o che i batteri svolgono un ruolo immunologico nella loro coesistenza con l'ospite, si apriranno nuove linee di ricerca. Soggetti come la chemioterapia anti-batterica/anti-simbionte di EC e nuovi aspetti dell'immunologia di EC potrebbero essere esplorati a partire da questa scoperta.