Saggio di binding utilizzando spettrometria di massa: indagine preliminare utilizzando il recettore GPR17

This experimental thesis was carried out during my Erasmus Exchange in the Department of Pharmacy of Ludwig Maximilian University (LMU) in Munich (Germany). GPR17 is a deorphanized G-protein coupled receptor (GPCR) that respond to two endogenous ligands: nucleotide sugars and cysteinyl leukotrienes and it is involved in neurodegenerative diseases like multiple sclerosis. MS binding assay is an innovative binding assay in which the amount of a nonlabeled marker bound to the target is quantify by LC-ESI-MS/MS after separation from unbound marker present in incubation mixture after separation by vacuum filtration. In this thesis the best LC-MS parameters for the detection of a GPR17 ligand agonist, Asinex 1, selected among five compounds, were established. The best chromatographic conditions were found using a mobile phase consisted of Acetonitrile (CH3CN):10 mM Ammonium Formate (NH4HCO2) buffer at pH 7,0 55:45 (v/v) and an isocratic elution profile run at a flow rate of 450 microL min-1, injection volume of 50 microL and a total run time of 2,5 minutes. A preliminary MS binding assay using Asinex 1 as reporter ligand and GPR17 as target was carried out. Another GPR17 ligand (Cangrelor) was instead used as competitor for the same receptor binding site to estimate the nonspecific binding. The aim of the present work is to verify if it is possible to quantify the binding event with an MS based binding assay.

Il presente lavoro di tesi sperimentale è stato fatto durante il mio periodo di scambi Erasmus nel Dipartimento di Farmacia dell’Università Ludwig Maximilian (LMU) di Monaco di Baviera (Germania). GPR17 è un recettore recentemente deorfanizzato accoppiato a proteine G (GPCR) che risponde all’azione di due diversi ligandi endogeni: zuccheri nucleotidici e cisteinil leucotrieni. Il recettore in questione è coinvolto in malattie neurodegenerative come la sclerosi multipla. Il saggio di binding sviluppato prevede l’impiego della cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa e permette di valutare l’interazione di un ligando non radio marcato legato al target di interesse mediante LC-ESI-MS/MS dopo averlo separato attraverso filtrazione sottovuoto dal ligando non legato al target. In questo lavoro di tesi sono state ricercate le migliori condizioni LC-MS per la quantificazione di Asinex 1, un agonista di GPR17, selezionato tra cinque differenti composti. Le condizioni cromatografiche migliori sono state individuate usando una fase mobile costituita da Acetonitrile (CH3CN):10 mM Formiato d’Ammonio (NH4HCO2) a pH 7,0 in rapporto 55:45 (v/v) ed eluizione in isocratica a velocità di flusso di 450 microL min-1, volume di iniezione di 50 microL e tempo di analisi di 2,5 minuti. E’ stato eseguito un saggio preliminare di binding usando Asinex 1 come ligando e GPR17 come target. Un altro ligando di GPR17 (Cangrelor) è stato utilizzato come competitore per lo stesso sito attivo recettoriale per valutare il legame non specifico dell’analita di interesse.