Exploring HuD protein as a potential therapeutic target: interaction study with small molecules by STD-NMR

Esplorazione della proteina HuD come potenziale bersaglio terapeutico: studio di interazione con piccole molecole mediante tecnica STD-NMR Abstract Questo progetto di tesi ha riguardato lo studio di HuD, una RNA binding protein della famiglia delle ELAV (Embryonal Lethal Abnormal Vision), come potenziale target terapeutico; in particolare lo scopo del mio lavoro è stato quello di verificare il grado di interazione di molecole selezionate con la proteina, tramite tecniche NMR (Nuclear Magnetic Resonance) di bioaffinità. Questo studio si inserisce in un più ampio lavoro interdisciplinare che si pone come obiettivo l’ottenimento di composti in grado di modulare il complesso HuD-RNA, coinvolto soprattutto in malattie neurodegenerative. Al fine di indentificare molecole in grado di legare la proteina HuD sono stati ad oggi seguiti due differenti approcci: 1. è stato effettuato uno screening virtuale in silico di librerie di composti, in collaborazione con il gruppo di ricerca del professor Stefano Alcaro dell’Università “Magna Grecia” di Catanzaro. Sono così state identificate alcune molecole naturali con le caratteristiche necessarie all’interazione. 2. è stata effettuata una progettazione diretta in silico utilizzando una piattaforma di Virtual Screening e analizzando le caratteristiche dei gruppi funzionali più affini al sito di legame per l’RNA. In tal modo sono state disegnate “ad hoc” nuove molecole, in collaborazione col gruppo di ricerca della professoressa Anna K. H. Hirsch dell’Università di Groningen. Le molecole più promettenti sono quindi state sintetizzate. Il mio lavoro di tesi ha inizialmente previsto la caratterizzazione completa dei composti selezionati e lo studio di solubilità e stabilità, tramite tecniche NMR mono e bidimensionali. Successivamente, gli stessi composti sono stati sottoposti a studi di interazione con la proteina HuD utilizzando principalmente la tecnica STD-NMR (Saturation Transfer Difference). Questa tecnica si basa sul trasferimento di magnetizzazione tra i segnali della proteina (selettivamente irraggiata con una radiofrequenza) e quelli del ligando. Da uno spettro STD è possibile ottenere informazioni sui protoni del ligando che sono coinvolti nell’interazione con la proteina, poiché l’intensità di un segnale è proporzionale alla vicinanza del protone al sito di binding, con la tecnica STD è possibile effettuare il cosiddetto epitope mapping. I risultati ottenuti hanno permesso di individuare quali molecole fossero le più promettenti; quest’ultime fungeranno da base per ulteriori studi di interazione tra ligando ed mRNA e di competizione tra ligando e complesso HuD-mRNA. In seguito, per indagare la potenziale selettività di queste molecole verso la proteina target, le stesse molecole sono state sottoposte ad un ulteriore studio di interazione in presenza di HuR, proteina ubiquitaria e coinvolta nello sviluppo di tumori, isoforme di HuD con circa il 75-80% di omologia di sequenza. Il confronto di questi risultati preliminari ha evidenziato che in generale tutti i composti hanno affinità sia per HuD che per HuR, come ci si poteva aspettare sulla base sia dell’elevato grado di omologia delle due proteine sia dallo studio in silico. Sorprendentemente, un composto ha dimostrato affinità preferenziale per HuD ed un altro per HuR. In conclusione lo studio condotto nell’ambito di questa tesi ha dato risultati molto promettenti per il prosieguo dello studio di HuD come nuovo target terapeutico ed in particolare per l’identificazione di ligandi in grado di modularne il complesso con l’RNA. Le molecole identificate saranno sottoposte ad una futura ottimizzazione strutturale guidata dai dati NMR e ad un’ulteriore indagine di selettività.