Sviluppo di un biorettore a base di enterochinasi per la preparazione di proteine di interesse farmaceutico

In the pharmaceutical field, the recombinant DNA technology is largely used to synthesize biological active compounds, such as vaccines, monoclonal antibodies and enzymes for the treatment of different diseases (cancer, diabetes, infections etc.). The production of recombinant proteins for human use is a complicated process that starts from the right choice of the host and cellular line to the products purification. One of the most common approach to optimize the production process is the development of recombinant products expressed in fusion constructs. These constructs are the fusion of the needed protein with particular aminoacidic sequences (tag), that are able to give to the construct a certain amount of proprieties essential to get the quality needed and enough yields. Once the protein is produced it must be cleaved from the tag as this can interfere with the biological activity. The tag cleavage is frequently achieved using enzymes with a high specificity for certain sequences. The enterokinase is one of the most common enzymes used in this step, it’s a heterodimeric serin-protease which consist in a light chain of 26,1 kDa, responsible of catalytic activity, bonded through disulfide bond to a heavy chain of 120 kDa. The feature that makes this enzyme so used in the recombinant protein synthesis is the high specificity to its recognition site, consisting of a series of five amino acids: four aspartic acids followed by a lysine. Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DDDDK); This thesis concerns the development of an enterokinase based chromatographic bioreactor used in the recombinant protein production process starting from fusion constructs to assure the stability and purity of the protein product. The enterokinase light chain has been bonded to monolithic supports through several immobilization protocols, which differ in bonding chemistry and enzyme unities loaded on the support. The activity and specificity of the synthetized bioreactors in the cleavage has been evaluated either on standard peptides and on pharmaceutical proteins. Two candidate vaccine proteins against TBC (TB10.4 e Ag85B-K23R) have been taken into account, these proteins have been studied in a multidisciplinary research project performed in the Pharmaceutical Analysis and Biocatalysis laboratories at Pavia University and in the Biotechnological and Life Science Department at the Insubria University. The expression of these proteins takes place through fusion constructs, in which the Tioredoxine (Trx) is used as tag to improve the solubility of the protein and a series of six histidine (His-tag) is used as affinity tag to purify the construct with IMAC. To separate the final product from the fusion construct, the cleavage sequence for enterokinase has been introduced in the right position, too. In the development of the enterokinase-based bioreactor several digestion methods have been used: on-line and with recirculation. Digestion products have been analyzed with HPLC-UV and HPLC-ESI-MS techniques. The study has established that the buffer used for the cleavage using the enterokinase based-bioreactor plays a central role in the absorption of proteins on the chromatographic support. Reducing the aspecific adsorption the hydrolysis yield greatly increased. Data obtained with the analysis of reaction products suggest that the immobilization technique considerably affect activity and specificity of the enzyme cleavage. The immobilization on epoxy monolithic silica seems to increase the enzymatic activity but the specificity is partially compromised.

In ambito farmaceutico la tecnologia del DNA ricombinante è ampiamente utilizzata per la sintesi di macromolecole biologicamente attive quali vaccini, anticorpi monoclonali ed enzimi utilizzati per il trattamento di diverse patologie (tumori, diabete, infezioni ecc.). La produzione di prodotti ricombinanti ad uso umano è un processo complesso che va dalla scelta dell’organismo ospite e della linea cellulare, alla metodologia di purificazione del prodotto. Un approccio comunemente utilizzato per ottimizzare il processo produttivo è lo sviluppo di prodotti ricombinanti espressi mediante i “costrutti di fusione”, che sono l’insieme della proteina di interesse e di particolari sequenze amminoacidiche (tag), ad essa legate, che gli conferiscono una serie di proprietà indispensabili per raggiungere standard qualitativi e resa quantitativa sufficientemente elevati. Una volta prodotta la proteina di interesse deve essere liberata dal tag che potrebbe essere di detrimento all’attività biologica. Il taglio della sequenza amminoacidica di tag spesso avviene per via enzimatica utilizzando enzimi altamente specifici per determinate sequenze. L’enterochinasi è tra gli enzimi più utilizzati in questo passaggio, si tratta di una serin-proteasi eterodimerica che si compone di una catena leggera di 26,1kDa, responsabile dell’attività catalitica, legata ad una catena più pesante di circa 120kDa attraverso un ponte disolfuro. La caratteristica principale di questo enzima, tra i più sfruttati, è l’elevata specificità verso la sequenza di riconoscimento costituita da una serie di cinque amminoacidi: 4 acidi aspartici seguiti da una lisina. (DDDDK); Il lavoro di tesi ha riguardato lo sviluppo di un bioreattore cromatografico a base di enterochinasi, utilizzabile nei processi di produzione di proteine ricombinanti a partire da costrutti di fusione al fine di garantire stabilità e purezza al prodotto. La catena leggera dell’enterochinasi è stata legata a supporti monolitici applicando più protocolli d’immobilizzazione, che differiscono per chimica di legame e per unità di enzima caricate. Sono state valutate attività e specificità di taglio dei bioreattori su peptidi standard e su proteine di interesse farmaceutico. In particolare sono state prese in considerazione due proteine come candidati vaccini contro la TBC (TB10.4 e Ag85B-K23R) che sono stati oggetto di studio in un progetto di ricerca multidisciplinare condotto presso i laboratori di Analisi Farmaceutica e di Biocatalisi dell’Università di Pavia e presso il Dipartimento di Biotecnologie e Scienze della vita dell’Università degli Studi dell’Insubria. La loro espressione avviene attraverso costrutti di fusione, dove la Tioredossina (Trx) è usata come “tag” per migliorarne la solubilità e una serie di 6 istidine (His-Tag) è usata come “tag” di affinità per la purificazione tramite IMAC del costrutto. Per separare il prodotto finale dal costrutto di fusione è stata inoltre introdotta la sequenza di riconoscimento dell’enterochinasi a livello del punto di taglio desiderato. Nella fase di sviluppo del bioreattore a base di enterochinasi sono stati utilizzati diversi metodi di digestione: on-line e in ricircolo. I prodotti di digestione sono stati analizzati tramite tecnica HPLC-UV e HPLC-ESI-MS. Lo studio condotto ha permesso di stabilire che il tampone utilizzato per il taglio con il biorettore a base di enterochinasi, gioca un ruolo importante nel minimizzare l’adsorbimento delle proteine di fusione sul supporto cromatografico. Riducendo l’adsorbimento aspecifico si aumenta la resa di idrolisi. I dati ottenuti suggeriscono che la chimica di immobilizzazione influenzi sensibilmente l’attività e la specificità di taglio dell’enzima. L’immobilizzazione su silice monolitica epossidica sembra garantire la maggiore attività enzimatica ma la specificità è parzialmente compromessa.