Studio dei meccanismi di resistenza all'apoptosi nei progenitori endoteliali circolanti isolati da soggetti sani e pazienti affetti da carcinoma cellulare renale

I progenitori endoteliali circolanti (EPC) sono cellule presenti nel sangue periferico di soggetti adulti, in grado di autorigenerarsi e proliferare, partecipando allo sviluppo della rete vascolare per la loro capacità di differenziare in cellule endoteliali mature. Il processo angiogenetico, ovvero la formazione di nuovi vasi sanguigni, nell’individuo adulto continua sia in condizioni fisiologiche che patologiche, come ad esempio nei tumori. Le Endothelial colony forming cells (ECFC) sono l’unica popolazione nota di EPC che mostra un fenotipo endoteliale e si incorpora fisicamente nei vasi neoformati. Quindi, le ECFC possono essere considerate il migliore esempio di EPC in vitro. Il nostro laboratorio ha dimostrato recentemente che i segnali intracellulari di Ca2+ giocano un ruolo fondamentale nell’attivazione delle ECFC e vanno incontro a un importante rimodellamento nelle ECFC isolate da pazienti affetti da carcinoma cellulare renale (RCC-ECFC). In particolare, studi precedenti hanno messo in evidenza che le RCC-ECFC presentano una diminuzione dei livelli di Ca2+ all’interno del reticolo endoplasmatico (RE), il principale deposito intracellulare di questo ione. Questo aspetto è importante considerato che il calcio rilasciato dal RE e diretto ai mitocondri, in seguito al legame dell’inositolo-1,4,5 trifosfato (InsP3) con i propri recettori, regola la via intrinseca dell’apoptosi. Il presente lavoro di tesi si è, quindi, posto l’obiettivo di verificare : 1) se il processo apoptotico viene inibito nelle RCC-ECFC; 2) quali fossero i meccanismi responsabili della riduzione dei livelli di calcio nel RE, indotto dall’InsP3; e 3) se tali differenze nel macchinario che sottende alla genesi dei segnali di Ca2+ si traducessero in modificazioni strutturali delle cellule e/o in modifiche del folding proteico. I nostri risultati hanno dimostrato che le RCC-ECFC sono più resistenti all’apoptosi indotta dalla rapamicina anche se esprimono livelli normali sia di Bcl-2, una proteina anti-apoptotica, sia di Bax, una proteina pro-apoptotica. In accordo con il ruolo del Ca2+ intraluminale nell’innesco del processo apoptotico, il BAPTA, un chelante del Ca2+ intracellulare, abolisce l’effetto della rapamicina nelle ECFC di controllo, che presentano una maggiore concentrazione di tale ione nel RE. Inoltre, sebbene le RCC-ECFC mostrino una diminuzione importante del contenuto di calcio nel RE e nei mitocondri, esse non presentano alterazioni nel sistema di trasporto del calcio o nelle proteine che legano il calcio del RE, come la calreticulina e la calnexina. E’, quindi, probabile che la caduta nei livelli intraluminali di Ca2+ sia dovuta alla ridotta attività della Ca2+-ATPasi del Reticolo SarcoEndoplasmatico (SERCA), dimostrata dal nostro gruppo in un lavoro precedente. Attraverso un’analisi al microscopio elettronico, si è osservato che nelle RCC-ECFC, il calo di Ca2+ nel RE è associato ad un’espansione di questo organello ed alla presenza di un numero maggiore di mitocondri rispetto alle cellule di controllo. Infine, sono stati valutati i livelli di ubiquitinazione che risultano essere maggiori nelle RCC-ECFC rispetto alla ECFC sane. In conclusione, questi dati suggeriscono che il riarrangiamento del Ca2+ toolkit potrebbe conferire un vantaggio adattativo alle RCC-ECFCs e indicano come il microambiente tumorale sia in grado di influenzare i progenitori endoteliali inducendo non solo non solo modificazioni biochimiche, ma anche strutturali.