Approccio in fase solida alla sintesi modulare di molecole chimeriche per l’induzione della degradazione di proteine

Protein degradation is an emerging area which proposes an alternative mechanism for suppression of the activity of a target protein compared to its inhibition. The technique exploits already available in-cell machinery, such as the Ubiquitinating Proteasome System (UPS), which is responsible for recruiting and degrading protein targets. This is a process where E3 ligases play a pivotal role by recognizing targets and promoting their ubiquitylation, which in turn, prompt their degradation by means of the proteasome. Based on this mechanism, bifunctional molecules, here dubbed TPDI (Target Protein Degradation Inducers) made up of an E3 ligase ligand and a protein target ligand joined by a suitable spacer (linker), have recently appeared in the literature; in principle, these molecules bring the ubiquitylating system and a given target protein in close proximity, promoting target ubiquitylation and eventually its degradation. The formation of the ternary complex (target protein-molecule-E3 ligase) is an articulated process influenced by a series of factors, such as intrinsic properties of the proteins involved, ligands affinity for their substrate and, last but not least, linker length and composition. Once established the nature of the ligands, it is clear that the linker characteristics may be crucial for the strategy success. In order to study the role played by the linker we have designed a modular synthesis on solid phase, which allows for the preparation of arrays of TPDIs where length and nature of the linker are diversified. In this thesis we described the synthesis in solution of a suitably functionalized ligand for an E3 ligase, its anchoring to solid phase, the strategy for the linker building and the preparation of a full TPDI suitable for the degradation of protein kinases.

L’induzione della degradazione di proteine rappresenta un approccio nuovo ed alternativo all’inibizione della loro attività. La tecnica sfrutta il meccanismo cellulare noto come UPS (Ubiquitinating Proteasome System), che è responsabile del reclutamento e della degradazione delle proteine stesse. Si tratta di un processo dove le ligasi di tipo E3 giocano un ruolo fondamentale, riconoscendo le proteine da degradare e promuovendone l’ubiquitinazione, passaggio indispensabile perché queste siano poi riconosciute e disassemblate dal proteasoma. Sulla base di questo principio sono state recentemente riportate in letteratura delle molecole bifunzionali, che noi qui chiamiamo TPDI (Target Protein Degradation Inducers) costituite da un ligando per una ligasi E3 e da un ligando per la proteina che si intende degradare (proteina target), uniti da un opportuno spaziatore (linker); queste molecole, in linea di principio, consentono al sistema ubiquitinante e alla proteina target di venire in stretto contatto tra loro, in modo da promuovere l’ubiquitinazione e in ultima analisi la degradazione della proteina target stessa. La formazione del complesso ternario tra molecola bifunzionale, proteina target e ligasi E3 è un processo articolato, influenzato da diversi fattori, quali le proprietà intrinseche delle proteine coinvolte, l’affinità dei ligandi per il loro substrato e, non ultimo, la lunghezza e la composizione del lnker. Stabilita la natura dei due ligandi, è chiaro che le caratteristiche del linker possono essere decisive per il successo della strategia. Per studiare il ruolo dei linker abbiamo progettato una sintesi modulare in fase solida che ci consente la preparazione di “librerie” di TPDI in cui viene variata la lunghezza e la natura del linker. In questo lavoro descriviamo la sintesi in soluzione di un ligando per una ligasi E3 derivatizzato con un opportuno gruppo funzionale, il suo ancoraggio alla fase solida, la strategia di accrescimento del linker e la preparazione di un TPDI completo per la degradazione di protein chinasi.