Chromatin organization and timing of polar body I extrusion identify developmentally competent and incompetent mouse oocytes

One third of women undergoing oncological treatment are at risk of premature ovarian failure. In vitro maturation (IVM) of germinal vesicle (GV) oocytes to metaphase II (MII) and their cryopreservation is a strategy for preserving female fertility (Chung et al., 2013; Kim et al., 2016). A critical point that could affect the outcome of human IVM is the selection of developmentaly competent oocytes that will, upon in vitro fertilization (IVF) treatment, complete preimplantation development (Antczak et al., 2010). Currently, the developmental potential of denuded oocytes is still low, leading to only 20% of success rate. A number of methods have been developed to easier distinguish between competent versus incompetent oocytes. Most of these methods are invasive and it is difficult to gain objectivity. The need of non invasive morphological markers is highly required. In search for non-invasive markers, the specific aim of this study was to investigate the relationship between chromatin organization at the GV stage, timing of polar body I (PB-I) extrusion and oocyte quality. Mouse GV oocytes were stained with the supravital fluorochrome Hoechst 33342 to reveal two distinct groups of oocytes, differing for their chromatin organization: surrounding nucleolus (SN) and non-surrounding nucleolus (NSN). Then, time-lapse observation of NSN and SN oocytes GV-to-MII transition brought up differences in the timing of germinal vesicle break down (GVBD) and PB-I extrusion. Specifically, PB-I, but not GVBD highlighted the presence of three main groups: Group A includes oocytes that extruded PB-I during a time-interval comprised between 456-576 min of maturation. Group B comprises oocytes that accomplished PB-I extrusion during a time-interval comprised between 584-728 min. And finally, Group C consists of oocytes attaining MI after 736-896 min of IVM. In a further set of experiments, unclassified oocytes were in vitro matured, divided into group A, B and C depending on the timing of PB-I extrusion, and in vitro inseminated. The data showed that Group A reached the blastocyst stage with higher frequency (28.3 ± 11.2%) compared to Group B (2.7 ± 5.3%). Group C, stopped preimplantation development at the 4-cell stage. Furthermore, the quality of blastocysts obtained after oocyte in vitro maturation was similar to that of those obtained from in vivo matured oocytes. In conclusion, based on these results, PB-I extrusion timing is predictive of the mouse oocyte developmental competence. In contrast, the time of GVBD is not a valuable parameter to select good quality oocytes. These results allow to distinguish between developmentally competent and incompetent oocytes, without the use of an invasive DNA-binding fluorochrome, thus opening to its use to the field of human and domestic animal reproduction.

"L’organizzazione della cromatina e il momento di estrusione del primo globulo polare permettono l’identificazione di oociti di topo competenti o incompetenti allo sviluppo." Un terzo delle donne sottoposte a trattamento oncologico sono a rischio di sindrome da decadimento prematuro ovarico. La maturazione in vitro (IVM) di oociti dalla fase di vescicola germinale (GV) a quella di Metafase II (MII) e la loro criopreservazione è una possible strategia per preservare la fertilità femminile (Chung et al., 2013; Kim et al., 2016). Uno dei fattori più importanti per la riuscita dell’IVM è la selezione degli oociti competenti allo sviluppo embrionale, ovvero quelli che, una volta fecondati in vitro (IVF), completeranno il sviluppo preimpianto (Antczak et al., 2010). Ad oggi, le rese di sviluppo di oociti denudati sono ancora basse, attestandosi a circa il 20%. Recentemente sono stati sviluppati metodi che permettono la selezione tra oociti competenti e non competenti, però, molti di questi sono risultati non solo invasivi ma anche poco obiettivi. Per questo motivo è importante identificare nuovi marcatori non invasivi della competenza allo sviluppo embrionale. Lo scopo principale di questa tesi è stato quello di indagare la relazione tra la configurazione cromatinica dell’oocita nella fase di GV, l’intervallo di tempo trascorso dall’inizio della maturazione e l’estrusione del corpo polare I (PB-I) e la competenza allo sviluppo dell’oocita. Gli oociti di topo sono stati colorati con il fluorocromo sopravitale Hoechst 33342 per caratterizzare due distinti gruppi in base alla loro configurazione cromatinica: oociti surrounded nucleolus (SN) e oociti non-surrounded nucleolus (NSN). L' osservazione time-lapse della transizione GV-to-MII degli oociti SN e NSN ha evidenziato differenze nei tempi di dissoluzione delle vescicole germinali (GVBD) e dell'estrusione del PB-I. In particolare, il PB-I, ma non la GVBD ha evidenziato la presenza di tre gruppi principali: il Gruppo A, include oociti che hanno estruso il PB-I durante un intervallo di tempo compreso tra 456-576 minuti di maturazione; il Gruppo B, comprende oociti che hanno estruso il PB-I durante un intervallo di tempo compreso tra 584-728 minuti; infine, il Gruppo C consiste di oociti che hanno raggiunto la MII dopo 736-896 minuti di IVM. Negli esperimenti successivi, gli oociti non classificati sono stati maturati in vitro, divisi nei gruppi A, B oppure C in base ai tempi di estrusione del PB-I e, successivamente, inseminati in vitro. I dati hanno mostrato che gli oociti del gruppo A hanno raggiunto lo stadio di blastocisti con maggiore frequenza (28,3 ± 11,2%) rispetto al gruppo B (2,7 ± 5,3%) (p< 0.05). Gli oociti del Gruppo C, arrestano lo sviluppo preimpianto allo stadio di 4 cellule. Inoltre, la qualità delle blastocisti ottenute dopo la maturazione in vitro dell’oocita è risulatata simile a quella di oociti maturati in vivo. In conclusione, sulla base di questi risultati, l’analisi dei tempi di estrusione del PB-I è risultata predittiva della competenza allo sviluppo degli oociti di topo. Al contrario, la dinamica temporale della GVBD non è emersa come parametro appropriato per selezionare oociti di buona qualità. Questi risultati permettono di distinguere tra oociti competenti e incompetenti senza far uso di fluorocromi invasivi, permettendo così un suo possible impiego nell’ambito della riproduzione di animali domestici e umana.