Coniugati naftalendiimmide-agente intercalante per il targeting di LTR-III G-quadruplex

It is common knowledge that the double helix structure is way the most represented in physiological conditions. However types of bond different from the Watson-Crick one can create the more variable architectures. One of the most prominent is the Hoogsteen hydrogen bond which connects one or two couples of guanine between them producing, in guanosine-rich sequences of genome like the human telomeric single-strand, guaninic tetrades. These structures possess a vast π-surface that allows them to efficiently stack one on the other through an effect called π-stacking. A G-quadruplex (G4) created in this way will be the more stable the more numerous are the quartets involved. The ability to recognize and stabilize/annihilate such a non-canonical DNA architecture represents a powerful theranostic mean for scientist devoted to medicinal chemistry. Given this reason the scientific research moved toward the discovery and use of small-molecules able to interact with G4s seeing in Kinetic Target Guided Synthesis (KTGS) a promising approach to identify the best ligands overall. KTGS, in facts, wants the biomolecular target itself to build ist own more stable ligand, not mandatorily the most active, from a given library of chemical compounds. Other positive characteristics of this methodology are that reaction used are fast, high in yeld, they work in physiological conditions and usually the products do not even require to be purified. This work of thesis explores that type of reaction that the same Sharpless described as the most suitable to Target Guided Synthesis: the click cycloaddition between alkynes and azides. Two different libraries have been produced: one composed of naphthalen di-imide (NDI) derivatives, which are well known for their ability to stack on top of G-quadruplexes, functionalized with alkylic chains terminating with an azide function. The other displays a various arrange of groove binding small molecules. In the second part of this thesis it has been proven, through a binary combination between the elements of those two libraries, that they do not react in physiological conditions in absence of the biomolecular substrate. After this mandatory control step, different KTGS experiments have been conduced in presence of the LTR-III target. It was, in fact, predicted and successfully proved that the target could catalyze the click reaction binding two molecules and forcing them to stay at a relatively small distance. Two different approaches were involved in this step oft he research: in the first place it was reproduced the binary combinatorial method, this time adding the target, in order to easily screen the whole lot of possible products. Then a multicomponent setup had been adopted: in separate vials were added a single NDI, a buffer solution (pH=7.4) containing LTR-III and all of the groove binders synthetized. This way it has been possible to detect and produce the most stable ligand for G4 of them all.

Sebbene la struttura a doppia elica sia la più rappresentata in ambiente fisiologico, essa non è certamente lunica disponibile per il DNA. Esistono, infatti, tipi di legami alternativi a quello descritto da Watson e Crick nel 1953. Un esempio importante è dato dal legame a idrogeno di Hoogsteen che permette linterazione di una o più coppie di guanine tra loro generando, in sequenze genomiche ricche di guanosine come può essere il single strand telomerico umano, delle tetradi guaniniche. Questi assembramenti posseggono una vasta superficie-π che permette loro di impilarsi efficacemente mediante un fenomeno chiamato π-stacking. Un G-quadruplex (G4) così formato risulterà essere tanto più stabile quanti più quartetti parteciperanno alla struttura. 114 Il possibile riconoscimento e susseguente eliminazione/stabilizzazione di una simile struttura non canonica per il DNA rappresenta per la medicinal chemistry un potentissimo strumento di teragnostica. Ci si è mossi, dunque, verso la scoperta e lutilizzo di small-molecules in grado di legarsi ai G4 intravedendo nella Kinetic Target Guided Synthesis (KTGS) un efficace sistema per lidentificazione dei leganti più efficienti. 177 Un approccio KTGS, infatti, prevede che sia il target biomolecolare stesso a costruire, partendo da una data libreria di composti, il legante più stabile per sé anche se non per forza il più attivo. Ulteriori fattori positivi legati a questo metodo si riscontrano nelle reazioni utilizzate. Esse, infatti, risultano essere tutte relativamente rapide e con buone rese, non sono solite necessitare di ulteriori purificazioni e funzionano in ambiente fisiologico. 246 Questo lavoro di tesi si è dunque soffermato su quella famiglia di reazioni che lo stesso Sharpless definì ideali per svolgere Target Guided Synthesis: la reazione di cicloaddizione click tra alcheni e azidi. Affianco ad una breve libreria di naftalen-diimidi (NDI) mono- e di- sostituite con catene di varia lunghezza riportanti una funzione azidica, di cui è già ben conosciuta la capacità di legarsi topicalmente al G4 per π-stacking, si è prodotta unulteriore libreria di small molecules in grado di dare groove binding con il quadruplex. Nella seconda parte di questo lavoro, ci si è assicurati, tramite una combinazione binaria degli elementi delle due librerie, che in condizioni fisiologiche prive del substrato biomolecolare non avvenissero reazioni tra le NDI e i groove binders. Successivamente si sono effettuate le prove di KTGS in presenza di LTR-III. In questo caso si prevedeva, come poi è accaduto, di poter osservare la formazione dei prodotti di click, poiché la presenza del substrato catalizza la reazione legando a sé due diverse molecole reattive e ponendole in questa maniera entro una distanza relativamente breve luna dallaltra. 430 Gli esperimenti svolti in questa fase hanno seguito due diverse metodologie: in un primo momento si è proceduto via combinazione binaria uno a uno dei composti appartenenti alle due librerie, in presenza del target, in questo modo si è potuto ottenere uno screening chiaro di tutti i coniugati possibili. Successivamente si è adottato un setup multicomponente per il quale in diversi vial sono stati posti: una diversa NDI, una soluzione tamponata (pH=7.4) di LTR-III e tutti i groove binders sintetizzati così che fosse possibile ottenere un risultato univoco riguardante il legante per G4 effettivamente più stabile, tra tutti quelli possibili.