Generazione di due modelli recessivi di Osteogenesi Imperfecta mediante tecnologia CRISPR/Cas9 e loro caratterizzazione

Introduction. Osteogenesis Imperfecta (OI) is a heritable disease characterized by bone deformity, skeletal fragility and growth delay. CRTAP and P3H1 are components of the collagen prolyl-3-hydroxylation ER-resident complex, responsible for the hydroxylation of the Pro986 in the α chains of collagen type I. Mutations in these proteins cause the recessive OI type VII and VIII, respectively. The highly conserved bone developmental pathways and ossification types between tetrapod and teleosts supported in the last years the use of zebrafish as tool to study skeletal diseases, such as Osteogenesis Imperfecta. The availability of zebrafish models will allow to deeply understand the phenotype even at early developmental stage and to perform drug screening effectively in terms of number of tested molecules and cost. My Master project aimed to generate and characterized knock-out models for crtap and lepre1. Methods. Synteny analysis was performed using the genome browser Genomicus v88.01. gRNAs were selected using the CHOPCHOP software; pT7gRNA and pT3TS-nCas9n vectors were used for gRNAs and Cas9 mRNA synthesis, respectively. The mRNAs were injected in 2-4 cells fertilized embryos. Mutants were identified by PCR followed by T7 endonuclease or enzyme specific digestion. Histomorphometric measurements at different developmental time points were performed using the Leica LAS v4.5 software. Alizarin Red staining and x-Rays analysis were used for bone characterization, while mutant collagen type I was analysed by SDS-PAGE. Results. lepre 1and crtap are quite conserved between tetrapods and teleosts. We successfully generated the knock-out for both genes in zebrafish using CRISPR/Cas9 genome editing system. We obtained several mutants for both genes and we performed the deep phenotype characterization of the lepre1 carrying a stop codon at aa 266 and the crtap carryinf a stop codon at aa 80. lepre1 and crtap homozygous mutants are smaller than WT and show delay mineralisation. Their phenotype is worsening with the age. Adult mutant fish are characterized by disorganization of the vertebral column and skeletal deformity. Collagen type I has abnormal electrophoretic migration. Conclusion. We proved the goodness of zebrafish model to reproduce the phenotype of recessive OI type VII and VIII. In the future, our goal will be to use lepre1 and crtap mutant models for drug screening in order to test new pharmacological treatments.

Introduzione. L’Osteogenesis Imperfecta (OI) è una malattia ereditaria caratterizzata da deformità ossee, fragilità scheletriche e ritardo nella crescita. CRTAP e P3H1 appartengono al complesso del reticolo endoplasmatico che idrossila in posizione 3 la prolina 986 della catena α1 del collagene di tipo I. Mutazioni in queste proteine causano rispettivamente le forme recessive di OI di tipo VII e VIII. Ad oggi non esiste cura per questa malattia e la possibilità di effettuare screening farmacologici utilizzando lo zebrafish (Danio rerio) sembra promettente grazie alla rapida riproduzione, al grande numero di progenie, alla trasparenza degli embrioni, alla fertilizzazione esterna e al fatto che il genoma del pesce è stato completamente sequenziato. Lo scopo della mia Tesi di Laurea è stato generare i modelli knock-out per crtap e lepre1 mediante tecnologia CRISPR / Cas9 e, successivamente, di caratterizzarli. Metodi. L’analisi si sintenia è stata effettuata utilizzando il browser Genomicus v88.01. Le sequenze target per i due geni sono state selezionate tramite il software CHOPCHOP, mentre i vettori pT7gRNA e pT3TS-nCas9n sono stati utilizzati rispettivamente per la sintesi degli RNA guida e dell’mRNA codificante l’endonucleasi Cas9. L’analisi dei genotipi è stata effettuata mediante PCR seguita da digestione con l’endonucleasi T7 o con specifici enzimi di restrizione. Le misurazioni istomorfometriche a diversi stadi di sviluppo sono state eseguite usando il software Leica LAS v4.5. La caratterizzazione ossea è stata effettuata mediante colorazioni istologiche con Alizarin Red e analisi radiografiche, mentre il collagene di tipo I è stato analizzato con SDS-PAGE. Risultati. L’analisi della sintenia della regione cromosomica di lepre1 e crtap fra diverse specie rivela un discreto livello di conservazione. Abbiamo generato con successo i modelli knock-out per entrambi i geni. Abbiamo selezionato i mutanti omozigoti per lepre1 e crtap, caratterizzati rispettivamente da un prematuro codone di stop all’aa 266 e 80, per la caratterizzazione fenotipica. Entrambi i modelli mostrano un ritardo nella crescita e nella mineralizzazione ossea rispetto ai WT. Durante lo sviluppo, il fenotipo si aggrava e diventa evidente una generale disorganizzazione scheletrica. L’analisi elettroforetica del collagene di tipo I, estratto da code di pesci omozigoti, è rallentata e rivela la presenza di collagene overmodificato. Conclusione. Abbiamo creato due validi modelli zebrafish per le forme recessive di OI di tipo VII e VIII che riproducono il fenotipo descritto nei pazienti. In futuro, il nostro obiettivo sarà di utilizzare questi modelli knock-out per lo screening di farmaci, al fine di testare nuovi trattamenti farmacologici.