Imaging dell'attività neuronale corticale con indicatori funzionali red-shifted durante esecuzione di task motorio

Project objective Intracellular concentration of free calcium ions in neuronal populations can be longitudinally evaluated by using fluorescent protein indicators, called genetically encoded calcium indicators (GECIs). In detail, GECIs with long emission wavelengths are particularly attractive for deep tissue microscopy in vivo. Red-shifted GECI have the additional advantage of avoiding spectral overlap with commonly used neuronal actuators like Channelrhodopsin. The objective of this project is the screening of few-selected red-shifted GECI to perform an in vivo study of mouse cortical-activity during motor task execution. To that end, wide-field fluorescent microscopy and a robotic mouse platform were combined for simultaneous recording of both cortical neuronal-activity and force applied by its controlateral limb. At first, four different GECI have been tested. I have induced their expression at primary sensory cortex level through viral vector injection. Once identified RCaMP1a as the best indicator in terms of sensitivity and dynamic range, we used the construct to analyse the cortical neuronal activity during learning and execution of the motor task on the robotic platform. The results obtained with this RCaMP sensor have been compared with those obtained using the more commonly used green fluorescence GCaMP6f sensor. This project is divided into two phases: PHASE I The objective of this part is the identification of the best red-shifted calcium indicators in terms of sensitivity and extension of transfection. We characterized four different GECI (RCaMP1a, RCaMP1b, REGCO1a e RGECO1b) through non-invasive fluorescence imaging studies of spontaneous cortical neuronal-activity in awake mouse. Their fluorescence variation has been cross-evaluated in vivo for one month. To do this we performed the following steps: 1. In vivo intraparenchymal injection of adeno-associated virus into the sensorimotor cortex of C57BL/6 mice. 2. A cranial window is made to guarantee optical access to the mouse cortex; the following implantation of a metallic post allows immobilizing the head of the mouse during recording with wide-field fluorescent microscopy. 3. Imaging analysis to quantify in-vivo the fluorescence extension in both space and time. Furthermore, change of neuronal-activity, whit annexed correlation matrix, has been evaluated for each construct on five specific cortical regions of interest (ROIs). 4. Ex-vivo analysis to evaluate caudal-rostrum extension of transfection and identification of cerebral areas involved in the trasfection. PHASE II Once identified the most performant indicator in terms of sensitivity and dynamic range (RCaMP1a), mice have been transfected at primary motor cortex level whit RCaMP1a. We used the construct to analyze the cortical neuronal activity during mouse’s learning and execution of a forelimb-pulling task in a robotic device, through simultaneous recording of both neuronal-activity and forces applied by its controlateral limb during active limb retraction. Our results show that RCaMP1a can be successfully used to perform longitudinal imaging of awake mice. Finally, the data obtained from the RCaMP sensor have been then compared with those obtained, under the same conditions, from the GCaMP6f sensor. We show that GCaMP6f gave better results than RCaMP1a sensor in terms of activation speed and intensity.

Obbiettivo del progetto La concentrazione intracellulare di calcio libero in una popolazione neuronale può essere valutata nel lungo periodo attraverso l’utilizzo di indicatori fluorescenti proteici, denominati genetically encoded calcium indicators (GECIs). Nel dettaglio, GECIs con lunghezze d’onda di emissione lunghe sono particolarmente interessanti per tecniche di microscopia in vivo in tessuto profondo. In particolare i red-shifted GECI hanno l’ulteriore vantaggio di evitare sovrapposizioni spettrali (cross-talk) con proteine comunemente usate per la stimolazione neuronale controllata come le Channelrhodopsin. Il seguente progetto di tesi ha come obbiettivo la caratterizzazione di pochi selezionati red-shifted GECI allo scopo di studi in vivo dell’attività corticale, nel topo, durante esecuzione di un task motorio. A tal fine, la microscopia a fluorescenza a campo largo ed una piattaforma robotica per topi sono state combinate per registrare simultaneamente l’attività neuronale corticale e le forze applicate dall’arto controlaterale. In primo luogo sono stati testati quattro differenti GECI: sono stati fatti esprimere a livello della corteccia sensoriale primaria tramite iniezione di vettori virali. Una volta individuato l’RCaMP1a come l’indicatore con le performance migliori in termini di sensibilità e range dinamico, abbiamo utilizzato il costrutto per analizzare l’attività neuronale corticale a seguito dell’apprendimento e esecuzione di un task motorio nella piattaforma robotica. I rislutati ottenuti con il sensore RCaMP sono stati poi confrontati con quelli ottenuti usando il più comune sensore GCaMP6f (che emette nel verde). Il progetto è suddiviso in due fasi: FASE I L’obbiettivo di questa fase è l’identificazione del miglior indicatore calcio red-shifted in termini di estenzione e trasfezione. Sono stati caratterizzazione di 4 differenti GECI (RCaMP1a, RCaMP1b, RGECO1a e RGECO1b) mediante studi non invasivi di imaging in fluorescenza dell’attività neuronale corticale spontanea in topi svegli. La variazione di fluorescenza è stata valutata, in vivo, per un periodo di un mese. Per la valutazione si è proceduto alle seguenti operazioni : 1. Iniezione intra-parenchimale in vivo del virus adeno-associato a livello della corteccia sensoriomotoria di topi C57BL/6. 2. Creazione di una finestra cranica per garantire accesso ottico alla corteccia con successivo impianto di un post metallico che consente l’immobilizzazione della testa del topo durante registrazioni con il microscopio a fluorescenza wide-field. 3. Analisi di imaging per la quantificazione in vivo dell’estensione della fluorescenza nello spazio e nel tempo. Inoltre è stata valutata per ogni costrutto la variazione dell’attività neuronale, con annessa matrice di correlazione, su 5 specifiche regioni corticali di interesse (ROI). 4. Analisi ex-vivo per la valutazione dell’estensione rostro-caudale della trasfezione e identificazione delle aree coinvolte. FASE II Una volta individuato il sensore con le migliori performance in termini di sensibilità e range dinamico (RCaMP1a) i topi sono stati trasfettati con solo RCaMP1a a livello della corteccia motoria primaria. Il costrutto è stato utilizzato per analizzare l’attività neuronale corticale durante apprendimento e esecuzione di un task motorio in un dispositivo robotico, mediante registrazione simultanea dell’attività neuroale e delle forze applicate dall’arto controlaterale durante la retrazione attiva dell’arto stesso. I risultati ottenuti mostrano che RCaMP1a può essere usato con successo per l’esecuzione di imaging nel lungo periodo su topi svegli. In conculsione, i dati ottenuti sul sensore RCaMP sono stati confrontati con quelli ottenuti, nelle stesse condizioni, sul sensore GCaMP6f: GCaMP6f presenta risultati migliori rispetto all’RCaMP1a in termini di velocità di attivazione e intensità.