Convalida di un metodo HPLC accoppiato a rivelatore rifrattometrico per l'analisi di zuccheri riducenti e lattato in soluzioni per emodialisi

The thesis describes the validation of an HPLC-RI method performed according to ICH Q2 (R1) guideline. This method is applied to some haemodialysis solutions for the analysis of glucose, fructose and lactate in presence of acetate and strong electrolites. This method is of consolidated use in the chemical laboratory of Baxter plant in Sondalo (Sondrio), where the work shown in this thesis was carried out. The validation was performed on a new instrument recently installed allowing the implementation among routine analysis. The strong point of the method is the column, which combined several separation mechanisms allowing the simultaneous determination of monosaccharides and organic acids under isocratic conditions with a minimal sample preparation (in this case, a simple dilution). The stationary phase is made of sulfonated polystyrene-divinylbenzene matrix in the hydrogen form. The main mechanism of separation is ion-exclusion, which allows the separation of partially dissociated molecules such as organic acids and with regard to this method it’s responsible for the separation of lactate from acetate (eluted respectively as lactic acid and acetic acid). Another mechanism involved is size-exclusion, which allows firstly the separation of monosaccharides from organic acids and secondly the separation of monosaccharides one each other. The validation demonstrated that the method is linear, accurate and precise in the ranges evaluated for the three analytes and it is robust in relation to the following parameters: mobile phase flow, column temperature, detector temperature, mobile phase concentration and substitution of the column with an equivalent one of different supplier.

La tesi descrive la convalida di un metodo analitico eseguita secondo la linea guida ICH Q2 (R1). La tecnica impiegata è la High Pressure Liquid Chromatography, accoppiata a detector ad indice di rifrazione. Il metodo in oggetto viene applicato ad alcune soluzioni per emodialisi e permette la determinazione quantitativa di glucosio, fruttosio e lattato in presenza di acetato ed elettroliti forti. Questo metodo è di uso consolidato presso il laboratorio chimico dello stabilimento Baxter di Sondalo (Sondrio) dove è stato svolto il lavoro presentato nell’elaborato; la convalida è stata eseguita su un nuovo strumento recentemente installato permettendone così l’implementazione nell’ambito delle analisi di routine. Particolare attenzione è da riservare alla colonna utilizzata, la quale, combinando più meccanismi di separazione, permette la contemporanea analisi di monosaccaridi e acidi organici in eluizione isocratica richiedendo per di più una minima preparazione del campione (nel caso delle applicazioni in oggetto, si tratta di una semplice diluizione). La fase stazionaria è costituita da una matrice polimerica a base di polistirene-divinilbenzene, derivatizzata con gruppi solfonici aventi ioni idrogeno come controione. Il principale meccanismo di ritenzione è l’esclusione ionica, che permette la separazione di molecole parzialmente dissociate come gli acidi organici e nel caso specifico è responsabile della separazione dello ione lattato dallo ione acetato (eluiti rispettivamente sotto forma di acido lattico e acido acetico). L’altro meccanismo che interviene nel caso del metodo in oggetto è l’esclusione sterica, che permette in primo luogo la separazione dei monosaccaridi dagli acidi organici e in secondo luogo la separazione degli stessi monosaccaridi l’uno dall’altro. Ulteriori meccanismi che si possono sommare che non intervengono nella separazione degli analiti oggetto dello studio ma che suggeriscono le potenzialità della colonna sono la ripartizione in fase inversa e lo scambio di ligando. La convalida ha dimostrato che il metodo è lineare, accurato e preciso nei range di concentrazione valutati per i tre analiti ed è robusto in relazione alla variazione dei seguenti parametri: flusso di fase mobile, temperatura della colonna, temperatura del detector, concentrazione della fase mobile, sostituzione della colonna con una equivalente di differente fornitore.