Studi strutturali sulle monoossigenasi di Baeyer-Villiger, con la combinazione di modelli cristallografici e modelli in silico

This master thesis deals with structural studies of the Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) cyclododecanone monooxygenase (CDMO) and cyclopentadecanone monooxygenase (CPDMO), combining crystallographic and in silico tools to characterize these two flavoenzymes. Enantioselective oxidations of compounds are difficult to accomplish chemically. Hence, enzymes that catalyze this reactions have attracted the attention of chemists during the last decades. Monooxygenases are enzymes that catalyze the insertion of an oxygen atom from O2 into an organic substrate. In order to perform this reaction, monooxygenases have to activate molecular oxygen to overcome its spin-forbidden reaction because of the spin-state of O2 (triplet state). In most cases, monooxygenases utilize cofactors to transfer electrons to molecular oxygen for its activation and the type of reactive intermediate that is formed depends on which cofactor is present in the enzyme. If no cofactor is present, the electron are obtained by the substrate itself. Monooxygenases are interesting biocatalysts, because of their chemo-, regio-, and/or enantioselectivity. There are different families of monooxygenases and the classification is based on the type of cofactor they require for catalysis. Flavin-dependent monooxygenases use flavin cofactors, FMN or FAD. In most cases the cofactor is tightly bound to the protein. They are more abundant in prokaryotic organisms and they are involved in a wide variety of pathways, such as degradation of aromatic compounds, polyketides biosynthesis, antibiotic resistance and biosynthesis of compounds as cholesterol and antibiotics. The reaction consists of an electron that is transferred from reduced flavin to triplet O2, forming a radical pair (superoxide and Flavin radical), which after spin inversion collapses into reduced oxygen (peroxide and oxidized flavin). BVMOs are the most studied flavin-dipendent monooxygenases, because of their remarkable enantio- and regioselectivity. These enzymes catalyze the oxidation of ketones to esters that has many biotechnological applications. BVMOs can be classified in three classes, type 0, type 1 and type 2. Type 0 and type 1 BVMOs both consist of one subunit; type 0 enzymes are NAD(P)H-dependent and have FAD cofactor bound on the surface, while type 1 are NADPH-dependent enzymes and contain FAD tightly bound into the protein. Type 2 BVMOs consist of two subunits, a reductase that reduces FMN with NADH and an oxygenase that uses the reduced FMN to perform the BV oxidation. In this thesis I will describe all the workflow pipeline, from protein expression and purification to crystallographic and SAXS data. I will also describe the experiments of other BVMOs (cyclohexanone monooxygenases), which with I had the chance to work during my internship.

Questa tesi magistrale si occupa di studi strutturali sulle monoossigenasi Baeyer-Villiger (BVMO) cicloododecanone monoossigenasi (CDMO) e ciclopentadecanone monoossigenasi (CPDMO), combinando strumenti cristallografici e strumenti in silico per caratterizzare questi due flavoenzimi. L'ossidazione enantioselettiva dei composti è difficile da eseguire chimicamente. Così, gli enzimi che catalizzano queste reazioni hanno attirato l'attenzione dei chimici negli ultimi decenni. Le monoossigenasi sono enzimi che catalizzano l'inserimento di un atomo di ossigeno da O2 in un substrato organico. Al fine di eseguire questa reazione, le monoossigenasi devono attivare ossigeno molecolare a causa dello stato di spin di O2 (tripleto stato), che renderebbe la reazione spin-proibita. Nella maggior parte dei casi, le monoossigenasi utilizzano cofattori per trasferire gli elettroni all'ossigeno molecolare per la sua attivazione e il tipo di intermedio reattivo che si forma dipende da quale cofattore è presente nell'enzima. Se nessun cofattore è presente, gli elettroni vengono ottenuti dal substrato stesso. Le monoossigenasi sono interessanti biocatalizzatori, a causa della loro regio- e / o enantioselettività. Ci sono diverse famiglie di monoossigenasi e la classificazione è basata sul tipo di cofattore che richiedono per la catalisi. Le monoossigenasi dipendenti dalla flavina usano i cofattori flavinici, FMN o FAD. Nella maggior parte dei casi il cofattore è strettamente legato alla proteina. Essi sono più abbondanti negli organismi procariotici e sono coinvolti in un'ampia varietà di pathway metabolici quali la degradazione dei composti aromatici, la biosintesi dei polichetidi, la resistenza agli antibiotici e la biosintesi di composti come il colesterolo e gli antibiotici. La reazione è costituita da un elettrone che viene trasferito dalla flavina ridotta al all’ossigeno, formando una coppia radicale (superossido e Flavina radicalica), che dopo l'inversione di spin orta alla riduzione dell’ossigeno (perossido e flavina ossidata). Le BVMOs sono le monossigenasi dipendenti dalla flavina più studiate, a causa della loro notevole enantio- e regioselettività. Questi enzimi catalizzano l'ossidazione di chetoni ad esteri che hanno molte applicazioni biotecnologiche. Le BVMOs possono essere classificati in tre classi, tipo 0, tipo 1 e tipo 2. Tipi 0 e tipo 1 sono entrambi costituiti da una subunità; Gli enzimi di tipo 0 sono NAD(P)H dipendenti e possiedono il FAD legato sulla superficie, mentre gli enzimi di tipo 1 sono NADPH-dipendenti e contengono FAD strettamente legato alla proteina. Le BVMO di tipo 2 sono costituite da due subunità, una riduttasi che riduce FMN tramite NADH e un'ossigenasi che utilizza FMN ridotto per eseguire l'ossidazione di BV. In questa tesi descriverò tutta la pipeline del mio lavoro, dall'espressione e dalla purificazione proteica ai dati cristallografici e dati SAXS. Descriverò anche gli esperimenti su altre BVMOs (cicloesanone monoossigenasi), con cui ho avuto la possibilità di lavorare durante il mio tirocinio.