Effetti dell’inibizione dell’enzima Ossido Nitrico Sintasi endoteliale (eNOS) sulla risposta infiammatoria corticale in un modello animale di ischemia cerebrale transitoria.

Ischemic damage is strongly influenced by inflammatory responses which involve soluble mediators and specialized cells, locally activated or recruited from the periphery. Therefore, during a cerebral ischemic stroke, a cross-talk between neurons, astrocytes, microglia and infiltrating leukocytes is observed. The immune response initially activated by the local ipoperfusion of the brain tissue is associated with a systemic activation of the immune system, followed by immunosuppression in order to limit the damage caused by the inflammation itself. Both neuronal and inducible Nitric Oxide Synthase (nNOS and iNOS) are activated by the ischemic stroke, thus increasing the Nitric Oxide (NO) production, which is involved in the ischemic damage. By contrast, NO produced by the eNOS has anti-inflammatory, anti-thrombotic and vasodilatatory effects. In this work we evaluated the effects of the inhibition of eNOS on the inflammatory response by systemic administration of l-N-(1-iminoethyl)ornithine (L-NIO), a selective inhibitor of eNOS, in a rat model of transient cerebral ischemia. A group of animals was treated with 10mg/kg of the inhibitor or with the same volume of vehicle (NaCl 0,9%), 15 minutes before the occlusion of the Middle Cerebral Artery (MCAo), with a silicone-coated nylon filament. The filament was removed one hour later to allow reperfusion and the animals were sacrificed 24 hour later. In addition sham-operated animals were subjected to the same surgical procedure, except for the insertion of the monofilament into the middle cerebral artery. The cortex was processed to evaluate the inflammatory effect of eNOS inhibition through the analysis of mir155-5p, a microRNA involved in microglial activation, by real time PCR. In addition, we analysed the pro-inflammatory (CD40+) macrophagic/microglial (CD68+) phenotype of both infiltrating and resident cells isolated from ischemic cortex by flow cytometry and we evaluated also the gene expression of iNOS and IL-10. tMCAo produced a significant elevation of miR155-5p and iNOS expression in the ischemic cortex as compared with sham surgery. eNOS inhibition by L-NIO treatment further elevated the cortical expression of these inflammatory mediators, while not affecting IL-10 mRNA levels. Interestingly, modulation of iNOS occurred in resident and infiltrating immune cells of the ischemic cortex. Accordingly, L-NIO induced a significant increase in the percentage of CD40+ events in CD68+ microglia/macrophages of the ischemic cortex as compared with vehicle-injected animals. These findings demonstrate that inflammatory responses may underlie the detrimental effects due to pharmacological inhibition of eNOS in cerebral ischemia.

L’entità del danno ischemico è fortemente influenzata da reazioni del sistema immunitario che coinvolgono mediatori solubili e cellule specializzate, attivate a livello locale o reclutate dalla periferia. Pertanto, durante un evento ischemico cerebrale si verifica un complesso cross-talk tra neuroni, astrociti, microglia e leucociti infiltranti dal versante sistemico. La risposta immunitaria che inizia localmente a livello dei vasi occlusi e del parenchima cerebrale ipoperfuso, si associa ad una risposta infiammatoria sistemica, cui fa seguito una fase d’immunosoppressione, finalizzata a limitare il danno mediato dall’infiammazione stessa. È noto che l’ischemia cerebrale è accompagnata dall'attivazione della ossido nitrico sintasi neuronale (nNOS) e dall'induzione della NOS inducibile (iNOS), che causano un aumento della produzione di NO che contribuisce al danno cellulare. Al contrario, l’NO prodotto dalla NOS endoteliale ha effetti vasodilatatori, anti-infiammatori e anti-trombotici. La disfunzione endoteliale, associata ad una ridotta espressione di eNOS, può contribuire infatti all'espansione della lesione ischemica, attraverso disturbi del microcircolo cerebrale, promuovendo infiammazione vascolare e produzione di agenti vasocostrittori e molecole di adesione. Nel presente lavoro di tesi abbiamo valutato l’effetto dell’inibizione dell’eNOS sulla risposta infiammatoria, attraverso la somministrazione sistemica di l-N-(1-iminoetil)ornitina (L-NIO), un inibitore dell’attività della eNOS, in un modello di ischemia cerebrale in ratto, basato sull’occlusione transitoria dell’arteria cerebrale media (tMCAo). Alcuni animali sono stati trattati con 10mg/kg dell’inibitore o con un volume equivalente del veicolo (NaCl 0,9%), 15 minuti prima di occludere l’arteria cerebrale media (MCAo), con un filamento ricoperto di silicone. Il filamento è stato rimosso un’ora dopo e gli animali sono stati sacrificati dopo 24 ore di riperfusione. Nello studio è stato anche incluso un gruppo di animali sham, che è stato sottoposto solo all’intervento chirurgico, senza inserimento del filamento. La corteccia è stata processata per valutare l’effetto infiammatorio dell’inibizione della eNOS, attraverso la valutazione del mir155-5p in real time PCR, un microRNA implicato nell’attivazione microgliale, e la valutazione del fenotipo macrofagico/microgliale (CD68+) pro-infiammatorio (CD40+) delle cellule infiltranti e residenti nell’area ischemica, attraverso citofluorimetria. Nella corteccia ischemica e nelle cellule macrofagiche/microgliali (residenti e infiltranti) è stata valutata anche l’espressione genica della iNOS e della IL-10. L’ischemia transitoria ha causato un aumento significativo dell'espressione di miR155-5p e iNOS nella corteccia ischemica rispetto agli sham. Il trattamento con L-NIO ha ulteriormente aumentato l'espressione corticale di questi mediatori dell'infiammazione, pur non influenzando i livelli di mRNA della IL-10, rispetto al gruppo ischemico trattato con veicolo. La modulazione della iNOS è stata osservata anche nelle cellule immunitarie residenti e infiltranti dell'emisfero ischemico. L-NIO ha causato un ulteriore aumento della percentuale di eventi CD40+ e CD68+ nella corteccia ischemica rispetto agli animali iniettati con il veicolo. I dati dimostrano che l'inibizione farmacologica della eNOS aumenta i livelli dei mediatori dell'infiammazione, compreso il miR-155-5p, e la percentuale di cellule residenti ed infiltranti con fenotipo pro-infiammatorio, a livello corticale dopo ischemia cerebrale transitoria. Pertanto, la modulazione dell'infiammazione rappresenta un importante meccanismo attraverso il quale l’NO derivato dalla eNOS può attenuare la lesione ischemica.