Hyaluronic acid - based nanoparticles targeting CD44 for breast cancer therapy: in vitro evaluation

VALUTAZIONE IN VITRO DI NANOPARTICELLE POLIMERICHE RIVESTITE DI ACIDO IALURONICO CON BERSAGLIO MOLECOLARE CD44: NUOVO APPROCCIO PER LA TERAPIA DEL CANCRO AL SENO. Il cancro al seno rappresenta ad oggi il 25% delle malattie che affliggono la popolazione femminile, con un valore di oltre 2,1 milioni di nuovi casi registrati nel 2018. I risultati ottenuti dopo il trattamento antitumorale, tuttavia, si rivelano spesso insoddisfacenti e non risolutivi, a causa dell’elevato potenziale metastatico delle cellule cancerose. Negli ultimi anni, quindi, una delle maggiori sfide nel campo medico – farmaceutico è stata la formulazione di sistemi nanoparticellari in grado di veicolare il farmaco verso un target specifico. Attaccare la componente staminale delle cellule presenti nel cancro al seno (BCSCs) permette di colpire selettivamente un tumore ormai resistente alle terapie convenzionali. A tal proposito, Everolimus (EVE), farmaco approvato dall’FDA per diverse tipologie di tumori (i.e. carcinoma renale refrattario, pancreatico avanzato, gastrointestinale e polmonare neuroendocrino) tra cui il cancro al seno triplo negativo, è stato incapsulato e veicolato selettivamente verso il recettore transmembranale CD44, al fine di inibire la proliferazione delle cellule tumorali, in cui è particolarmente iperespresso. Nanoparticelle polimeriche (NPs) a base di Chitosano (CS) sono state rivestite di Acido Ialuronico (HA), ligando naturale di CD44, al fine di garantire la selettività di veicolazione di EVE. Lo scopo alla base di questo studio risiede nella valutazione in vitro delle performances biologiche della forma farmaceutica nanoparticellare contenente EVE. La sintesi del nanocarrier è avvenuta tramite la tecnica della microfluidica: l’utilizzo della piattaforma NanoAssemblr™ dotata di micromixer SHM (Staggered Herringbone Micromixer) ha permesso di ottenere un risultato ottimale e altamente riproducibile, costituendo l’innovazione tecnologica di questo studio. Le NPs sono state caratterizzate dal punto di vista dimensionale e morfologico evidenziando forma sferica con carica superficiale negativa (-20,85 ± 3,16 mV) e diametro medio di 159,00 ± 7,28 nm (PDI = 0,306 ± 0,053). L’avvenuta complessazione ionica tra HA e CS è stata confermata dall’analisi FTIR e uno studio quantitativo tramite HPLC ha permesso di indagare in contenuto di EVE incapsulato: 88,12 ± 20,76 μg EVE/mg NPs. Tramite il saggio dell’MTT è stato possibile studiare il profilo di tossicità di nanoparticelle caricanti il principio attivo, constatando, dopo 90 min di trattamento ad una concentrazione di 12,5 µg/20.000 cell, un’effettiva riduzione del 50% sulla vitalità cellulare. Successivamente è stata testata l’attività inibitoria sulla proliferazione cellulare di HA/CS NPs caricate con EVE mediante saggio della Bromodeossiuridina; i risultati ottenuti rivelano inoltre una maggiore efficacia del farmaco incapsulato rispetto al farmaco in soluzione, con un numero di cellule in stato proliferativo inferiore all’ 1% sul totale. Per valutare l’uptake cellulare al microscopio confocale è stato necessario formulare NPs fluorescenti, utilizzando come fluoroforo la Rodamina B (RhB): questa molecola è stata coniugata con successo al CS (0.267 µg RhB / µg CS). Il massimo riscontro in termini di uptake cellulare è stato rilevato dopo le 4 h di incubazione, dove le NPs appaiano massivamente concentrate nel citoplasma grazie alla formazione di vescicole endocitiche osservate a 90 min di incubazione. Per concludere, tramite un test di binding competitivo anticorpo – recettore è stato possibile provare che le nanoparticelle rivestite di HA vengono internalizzate esclusivamente in presenza di CD44, confermando la selettività delle nanoparticelle oggetto di tesi.