Sindrome di Shwachman-Diamond: analisi di mutazione nel gene SBDS e correlazioni con un’anomalia citogenetica clonale.

La sindrome di Shwachman-Diamond è una malattia autosomica recessiva caratterizzata principalmente da insufficienza del pancreas esocrino, disfunzioni del midollo osseo e anomalie scheletriche. Particolarmente rilevante nella SDS è il rischio di sviluppare forme di mielodisplasia e leucemia. Altri segni clinici includono ritardo nell’accrescimento, difficoltà cognitive e comportamentali, complicazioni a livello renale ed epatico, infezioni ricorrenti. La diagnosi di SDS prevede che i pazienti affetti eseguano periodicamente un controllo morfologico e citogenetico (l’isocromosoma per il braccio lungo del cromosoma 7 e la delezione del braccio lungo del cromosoma 20 sono anomalie altamente peculiari) del midollo per monitorare il rischio associato alla sindrome di sviluppare mielodisplasie o leucemie. Nel 2003 è stato identificato SBDS come gene associato alla malattia: questo gene è coinvolto nel 90% dei pazienti osservati. Recentemente è stata confermata l’eterogeneità genetica della malattia, identificando in pazienti con fenotipo Shwachman mutazioni nei geni, DNAJC21 ed EFL1. La diagnosi di SDS viene fatta in base ai sintomi ed attraverso una serie di esami clinici, ma si completa con l’analisi molecolare del DNA. Nella prima parte del tirocinio per la tesi sono stati applicati i protocolli in uso nel laboratorio per la ricerca di mutazioni a partire da DNA estratto da sangue periferico in tre pazienti per i quali era stata avanzata l’ipotesi di SDS. Il lavoro di laboratorio ha avuto quindi l’obiettivo di definire in questi casi il genotipo SBDS con la ricerca delle mutazioni comuni dell’esone 2 (c.258+2T→C e c.183_184TA→CT), o delle mutazioni rare (nel caso in cui si identifichi una sola mutazione comune o il fenotipo clinico sia particolarmente caratteristico). Sono, quindi, state usate queste tecniche: estrazione del DNA genomico; amplificazione dell’esone 2 con primers specifici; digestione degli amplificati ottenuti con gli enzimi di restrizione specifici; analisi del pattern di restrizione; amplificazione con primers specifici dei 5 esoni del gene SBDS e delle regioni fiancheggianti; sequenziamento diretto degli amplificati ottenuti; analisi degli elettroferogrammi. La seconda parte del tirocinio per la tesi si è focalizzata ad approfondire i risultati ottenuti in due dei tre pazienti esaminati, nei quali, lo scopo di individuare la seconda mutazione nel gene SBDS ha portato all’applicazione di ulteriori tecniche molecolari non di routine (saggio dell’espressione della proteina SBDS, e Long-range gDNA PCR). Grazie alla collaborazione con il Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali e Cliniche dell’Università dell’Insubria, si è presentata la possibilità di analizzare il DNA estratto da midollo di un paziente nel quale il controllo citogenetico aveva dimostrato la presenza dell’isocromosoma per il braccio lungo del cromosoma 7. Il gene SBDS è localizzato sul braccio lungo del cromosoma 7, pertanto nell’iso7q sono presenti due loci di questo gene e, formandosi a partire da cellule di un paziente SDS, tale anomalia contiene due copie di una delle due mutazioni che compongono il genotipo del paziente. Quindi, la disponibilità di un nuovo caso con iso7q ha ampliato il lavoro del tirocinio per (1) determinare il genotipo di questo caso e dei genitori utilizzando marcatori disposti lungo il cromosoma 7, per identificare l’origine parentale dell’iso7q; (2) correlare i dati riguardanti l’origine parentale dell’anomalia con quelli relativi all’analisi di mutazione, eseguita in precedenza nel paziente e nei suoi genitori, per verificare quale delle due mutazioni possa risultare in dose aumentata in conseguenza dello sbilancio genico determinato dall’iso7q; (3) confrontare i dati sperimentali ottenuti con quelli pubblicati e con una valutazione dell’andamento clinico del paziente, in particolare riguardo al rischio di evoluzione in MDS/AML.