Modulazione diretta e allosterica di targets coinvolti nelle malattie neurodegenerative: strategie in silico

In this thesis, I will present the results of computational studies aimed at setting the stage for the design of novel direct and allosteric modulators of the two target proteins Sigma1 and Hsp70, involved in the etiopathology of several neurodegenerative conditions. Sigma1 is an intracellular protein, situated in MAM (mithocondria-associated membranes), which is involved in several physiologic mechanism like protection from oxidative stress, modulation of intracellular Ca2+ and N-methyl-D-Aspartate (NMDA) receptors and control of cell survival. Novel ligands developed in the Lab of Professor Collina are able to act as agonists of the receptor at nanomolar concentrations. Using a combination of advanced rigid docking and flexible docking approaches, I could develop a simple, quantitative Structure-Activity-Relationship model that provides a high correlation between calculated binding scores and experimentally observed activities. Importantly, the model highlights the parts of the ligands that are more relevant for activity. Such pharmacophoric points thus represent the starting point for the development of improved second-generation ligands. Hsp70 is an essential regulator of the folding and activation of a disparate ensemble of client proteins. It functions through ATP hydrolysis, which takes place at an active site which is highly conserved and widespread among different protein families. Perturbing Hsp70 functions through ATP-competitive inhibitors thus proved an inefficient strategy for drug development, due to poor binding and an excess of possible side effects. In contrast, allosteric modulators represent fundamental tools to obtain molecular insights into functional regulation and provide new possibilities to perturb Hsp70 functions in a specific way: indeed allosteric sites are less conserved than active sites and may have structural properties that vary among different proteins. Here, using Molecular Dynamics simulations and innovative methods of analysis of the trajectories, I have investigated the molecular and conformational determinants of the selective perturbation of Hsp70 functional dynamics by the allosteric ligand MKT-077. A novel model connecting allosteric binding and functionally oriented dynamic motions has been created and validated against a number of experimental observations. This model will be used to further shed light on the links between dynamic perturbation and functional outcomes, providing information on the complex relationships between protein structural motions and protein functions.

Le malattie neurodegenerative rappresentano un’emergenza sanitaria, in quanto i farmaci attualmente in uso non sono curativi, ma ne rallentano la progressione o ne alleviano i sintomi. Una delle ragioni che rende complessa l’identificazione di farmaci efficaci è l’origine di queste patologie. In questa tesi, presenterò i risultati ottenuti mediante studi computazionali mirati a supportare la progettazione di nuovi modulatori diretti ed allosterici di due proteine target Sigma 1 e Hsp70, che sono coinvolte in diverse condizioni neurodegenerative. Sigma 1 è una proteina intracellulare transmembrana, situata nella MAM (membrana mitocondrio-associata), ed è coinvolta in numerosi meccanismi fisiologici come la protezione dallo stress ossidativo, la modulazione di calcio intracellulare e dei recettori NMDA e il controllo della sopravvivenza cellulare. Il gruppo di chimica farmaceutica MedChemLab, coordinato dalla Professoressa Collina, ha individuato una serie di agonisti del recettore Sigma1, in grado di legarsi ai recettori con un’affinità nanomolare. Usando una combinazione di approcci di docking rigido e flessibile, ho sviluppato un modello semplice ed immediatamente applicabile che fornisce una buona correlazione tra i valori calcolati e predetti di affinità. Il modello è stato utilizzato per determinare le SARs (relazioni struttura-attività) ed ha permesso di definire gli elementi farmacoforici determinanti per l’attività biologica. Questi elementi farmacoforici sono il punto di partenza per lo sviluppo di ligandi ottimizzati di seconda-generazione (lead compounds). Hsp70 è un proteina che controlla il folding e l’attivazione di una serie di proteine clienti di diversa natura. La sua funzione dipende dall’idrolisi di ATP, che si verifica in un sito attivo altamente conservato e diffuso in svariate altre famiglie di proteine. Per questa ragione, la perturbazione della funzione di Hsp70 per mezzo di inibitori che competono con l’effettore ATP si è rivelata una strategia non ottimale per lo sviluppo di un potenziale farmaco. In questo contesto, al contrario, i modulatori allosterici rappresentano una possibile strategia alternativa per regolare e perturbare la funzione di Hsp70 in modo specifico: infatti i siti allosterici sono meno conservati a livello di sequenza e struttura rispetto ai siti attivi, variano in diverse famiglie proteine e permettono quindi un targeting specifico. Usando simulazioni di dinamica molecolare e nuovi metodi di analisi delle traiettorie, ho potuto generare un modello molecolare dettagliato che riassume gli effetti indotti dal legante allosterico MKT-077 sulla dalla dinamica funzionale della proteina Hsp70. È stato quindi sviluppato un nuovo modello che permette di correlare la presenza del legante allosterico con la perturbazione dei moti dinamici funzionali. Il modello è stato validato badandosi su una serie di osservazioni sperimentali. Questo modello sarò usato per ottenere ulteriori informazioni a risoluzione atomica sulla relazione tra movimenti strutturali della proteina e la sua attività fisiologica.