Studio dell’effetto del pH della fase mobile per la caratterizzazione delle impurezze di Mepartricina mediante HPLC-UV-MS/MS

Mepartricin is a semi-synthetic drug derived from molecules produced by Streptomyces aureofaciens coltures by fermentation, marketed in Italy by Società Prodotti Antibiotici since the mid-Seventies. Currently medicines containing Mepartricin are used as antifungal and antiprotozoal antibiotics or as treatment for benign prostatic hyperplasia-related disorders. At the Pharmaceutical Analysis laboratory of the University of Pavia’s Drug Sciences Department a chromatographic method made compatible with mass spectrometry has been developed for Mepartricin impurity profiling, in collaboration with the company responsible for producing the active substance on behalf of Società Prodotti Antibiotici. In fact, literature and guidelines provide evidence that UV spectroscopy as detection technique is not sufficient when aiming at every single impurity’s structure elucidation. Thanks to the information gained through HPLC-UV/MS2 analysis, it was possible to hypothesize the structures of substances detected in Mepartricin samples sent by the company. However, the MS-based approach proved to be inadequate to identify all impurities, due to the presence of various isobar species and the fact that the drug molecule is fragmented into only two fragments, so that it was impossible to take full advantage of tandem mass spectrometry’s potential. In light of the chemical properties of Mepartricin and its main related impurities, as well as of the available technical equipment, it was considered appropriate to initiate a study to test the benefits of a further discrimination of impurities based on their chromatographic behavior with mobile phases at different pH values. Experiments focused on impurities-related fractions collection and their analysis with mobile phases at different pH, using a suitable HPLC-UV/MS method. A comparative analysis of the data thus obtained led to confirm hypothesis regarding the behavior of the free carboxylic moiety owned by only Partricin and its derivatives. In addition, a peculiar behavior of Mepartricin at pH 6.5 was observed, for which a possible explanation has been proposed. The study of mobile phase pH effect has proved to be a good strategy to be added to the HPLC-UV/MS2 method in Mepartricin impurity profiling. Nonetheless, our findings show that a clear distinction between Mepartricin A and Mepartricin B species is still unattainable, which in fact would be necessary to make the impurity profiling of this drug complete.

La Mepartricina è un farmaco ottenuto per semi-sintesi da molecole prodotte per fermentazione da colture di Streptomyces aureofaciens, introdotto in commercio in Italia a metà degli anni Settanta dall’azienda Società Prodotti Antibiotici. Attualmente esistono sul mercato specialità medicinali di Mepartricina indicate o come antibiotico antimicotico e antiprotozoario per uso ginecologico, oppure come trattamento dei disturbi legati all’iperplasia prostatica benigna (indicazione aggiunta nel 1986). In collaborazione con l’azienda incaricata alla produzione del principio attivo per conto di Società Prodotti Antibiotici, presso il laboratorio di Analisi Farmaceutica del Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università di Pavia è stato sviluppato un metodo cromatografico che fosse compatibile con la spettrometria di massa per l’analisi del profilo di impurezze presenti in campioni di Mepartricina. Dati di letteratura e indicazioni contenute nelle linee guida testimoniano infatti che nella caratterizzazione qualitativa delle impurezze di un principio attivo il ricorso alla sola spettroscopia a ultravioletti come tecnica di rivelazione cromatografica è da considerarsi insufficiente, se si ha come obiettivo l’attribuzione di una struttura chimica alle varie impurezze. Grazie alle informazioni ottenute mediante le analisi eseguite con metodo HPLC-UV/MS2 sono state formulate ipotesi di attribuzione per le sostanze presenti sul tracciato di campioni di Mepartricina provenienti dall’azienda. Tuttavia questo approccio si è rivelato inadatto a risolvere l’identificazione di ogni impurezza, a causa della presenza di varie specie isobare e del fatto che la molecola di farmaco si frammenta in un solo punto, impedendo di sfruttare appieno le potenzialità della spettrometria di massa tandem. In considerazione delle proprietà chimiche della Mepartricina e delle sue principali impurezze, oltre che della strumentazione disponibile, si è ritenuto opportuno avviare uno studio per verificare l’utilità di un’ulteriore discriminazione delle impurezze basata sul loro comportamento cromatografico a diversi pH della fase mobile impiegata per l’analisi. Il lavoro sperimentale si è concentrato sulla raccolta di frazioni corrispondenti alle impurezze di interesse e sulla loro analisi con fasi mobili a pH diversi, applicando un metodo appositamente predisposto. L’analisi comparata dei dati così ottenuti ha permesso di confermare le ipotesi riguardanti il comportamento della funzione carbossilica libera a pH diversi presente solo sulle molecole di Partricina e derivati, e ha inoltre messo in luce un comportamento peculiare della Mepartricina a pH 6.5, per spiegare il quale è stata formulata un’ipotesi. Lo studio del ruolo del pH della fase mobile nella caratterizzazione delle specie dubbie si è rivelato una buona strategia da affiancare all’applicazione del metodo HPLC-UV/MS2. Nei risultati del presente lavoro è tuttavia emerso anche che esso non permette una chiara discriminazione tra le specie di Mepartricina (e Partricina) A da quelle di Mepartricina (e Partricina) B, la quale sarebbe invece utile a completare l’impurity profiling del farmaco.