Analisi della metilazione di regioni genomiche correlate con l'invecchiamento in DNA totale da sangue periferico e tessuto cardiaco umano in presenza o assenza di diabete mellito di tipo due

The aim of the thesis was the evaluation of DNA methylation in target sequences of ASPA, ITGA2B and PDE4C genes which are known to be related with aging. Samples from whole blood and cardiac auricles had been analysed. The donors were patients with type 2 diabetes (D) and patients without diabetes (ND) who underwent to aortic bypass position or valvolar substitution surgery. The patients have been groupped by their age in three chategories: 50-59 years, 60-69 years and 70-79 years in order to evaluate the role of diabetis in age-related genes. Polymerase chain reaction-High Resolution Melting (PCR-HRM) has been performed to check the difference of Melting temperature in ASPA, ITGA2B and PDE4C genes after DNA bisulfite conversion, a reaction which converts unmethylated cytosines in timines while methylated cytosines do not change resulting in a maintenance of C:G pairing. To confirm the HRM results, the pyrosequencing, more sensitive and precise tecnique than HRM, has been performed. This method is able to establish the percentage of methylation in each CpG islands by the sequencing of the target DNA.

In questo progetto di tesi si è voluta indagare la metilazione del DNA a livello di sequenze target nei promotori di tre geni ASPA, ITGA2B e PDE4C, già noti in letteratura per essere correlati con l’invecchiamento. Lo studio è stato effettuato su campioni di sangue intero e su campioni di tessuto cardiaco, le auricole, appartenenti a pazienti affetti da diabete mellito di tipo 2 e pazienti non diabetici, che sono stati sottoposti a intervento chirurgico di posizionamento di bypass aortico o sostituzione valvolare. I soggetti sono stati classificati in tre gruppi in base all'età: 50-59 anni, 60-69 anni e 70-79 anni, per valutare sia l’andamento della metilazione tra le tre diverse fasce d’età, che all’interno delle stesse usando la presenza/assenza di iperglicemia come fattore discriminante in modo da valutare il ruolo del diabete nel processo di invecchiamento. Le tecniche usate sono High Resolutin Melting (HRM) ed il Pirosequenziamento. La prima permette di determinare la temperatura di denaturazione del frammento amplificato dopo la conversione con il bisolfito e stimando il suo grado di metilazione usando un campione non metilato come normalizzatore. Successivamente è stato effettuato il pirosequenziamento delle sequenze target per confermare i risultati ottenuto con l’analisi HRM. Il pirosequnziamento è una metodica più sensibile e precisa che determina la percentuale di metilazione a livello delle singole CpG island presenti nel frammento amplificato.