Determinazione di α-fluoro-β-alanina (AFBA) in urina mediante UHPLC-MS/MS: validazione FDA e applicazione del metodo nella valutazione dell’esposizione professionale a CA

A method for quantitation of alpha-fluoro-beta-alanine (AFBA), the main metabolite of capecitabine (Cape) and 5-fluoruracil (5-FU), is described. Among antineoplastic drugs (ADs), 5-FU and Cape (the new oral prodrug) are the most commonly applied drugs in cancer therapy. The main objective of this study was to develop a reliable method that would be easy to run on a reversed-phase UHPLC system coupled to tandem mass spectrometry. AFBA was derivatized with Sanger's reagent to ensure complete yield of a stable 2,4 dinitrophenil-alpha-fluoro-beta-alanine derivative. This method was based on the use of a mixed-mode anion exchange solid phase extraction enabling urinary extracts to be clear of endogenous interferences affecting quantitative results. The assay was validated in human urine according to FDA criteria with the use of a labeled internal standard (beta-alanine-d4) to minimize experimental error. Good accuracy and precision were demonstrated by determining spiked urine QC samples in four consecutive days. The recovery of AFBA was between 70.0 and 82.6%, with a matrix effect that was 12.8% to 18.5%. The lower limit of quantitation (LOQ) was 0.5 ng/mL with a coefficient of variation of 5.3%. This assay was successfully applied to determine the levels of this metabolite in a large number of urine samples taken from personnel who were occupationally exposed to ADs.

Nel lavoro di tesi è stato descritto un metodo per la quantificazione di alfa-fluoro-beta-alanina (AFBA), il principale metabolita di capecitabina (Cape) e 5-fluoruracile (5-FU). Tra i farmaci antineoplastici (AD), 5-FU e Cape (il nuovo profarmaco orale) sono i farmaci più comunemente usati nella terapia del cancro. L'obiettivo principale di questo studio è stato quello di sviluppare un metodo affidabile e facile da eseguire su un sistema UHPLC a fase inversa accoppiato alla spettrometria di massa. L'AFBA è stato derivatizzato con il reagente di Sanger per garantire una completa resa e la stabilità del derivato 2,4 dinitrofenil-alfa-fluoro-beta-alanina. Questo metodo ha previsto, per l'estrazione in fase solida, l'utilizzo di una fase stazionaria scambiatrice anionica forte che consente di eliminare le interferenze endogene, presenti negli estratti urinari, che influenzano i risultati quantitativi. Il test è stato validato in urina umana secondo i criteri della FDA con l'uso di uno standard interno etichettato (beta-alanina-d4), per ridurre al minimo l’errore sperimentale. Una buona precisione e accuratezza del metodo sono state ottenute analizzando i campioni QCs nel corso di quattro giorni consecutivi. Il recupero di AFBA è stato calcolato tra il 70,0 e l’82,6%, con un effetto matrice compreso tra il 12,8% e il 18,5%. Il limite minimo di quantificazione (LOQ) è stato di 0,5 ng/mL con un coefficiente di variazione del 5,3%. Questo test è stato applicato con successo per determinare i livelli di questo metabolita in un gran numero di campioni di urina prelevati da personale professionalmente esposto ai Chemioterapici Antiblastici.