Colture cellulari a lungo termine da liquido follicolare di ovaio umano: fonte alternativa di cellule staminali mesenchimali per studi sperimentali nella ricerca biomedica

The field of stem cell biology is constantly evolving, with the characterization of multiple cellular types and the study of their potential experimental and clinical applications. The main characteristics of stem cells are self-renewal and differentiation. Mesenchymal stem cells (MSC) derive from mesoderm and have the potential to differentiate into osteogenic, chondrogenic, adipogenic and myocyte lines and MSCs isolated from bone marrow are the most studied. In literature, many studies demonstrate the presence of alternative sources of MSC in other tissue, with similarities and differences with mesenchymal cells from bone marrow. Multipotent cell progenitors, with mesenchymal phenotype and differentiative potentiality, have been isolated from adipose tissue, umbilical cord, dental pulp, amniotic fluid and placental tissue. Furthermore, recent researches show that stem cells are present into granulosa cells (GC) of healthy ovarian follicular antrum. In particular during the formation of secondary follicles, the deepest follicular cells produce small amounts of follicular fluid (FF). This fluid contains a cell population with mesenchymal stem cell features, as demonstrated in works based on the biological analysis of the contents of routine discarded ovarian follicular fluids during the procedure of oocytes pick-up for medically assisted fertilization. The purpose of my experimental thesis was to consider these mesenchymal stem cells in the ovarian follicular fluid as an alternative source to MSC derived from bone marrow for possible applications in biomedical research. Therefore, the main experimental objective was to evaluate the maintenance of the stem cell characteristics at subsequent steps in adhesion cultures and after freezing/thawing process in nitrogen. Thus, a panel of experiments was design to analyze the proliferative activity, cellular viability, adhesion ability, expression of typical mesenchymal markers and differentiation potential characterizing this FF-MSC population that has been studied at the first step in adhesion culture on different support.

La ricerca biologica relativa alle cellule staminali è in continua evoluzione, con la caratterizzazione di molteplici tipi cellulari e con lo studio delle loro potenziali applicazioni sperimentali e cliniche. La staminalità cellulare si definisce sulla base di due caratteristiche fisiologiche fondamentali, l’autorinnovamento ( self- renewal) e la potenzialità differenziativa. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) derivano dal mesoderma e hanno la potenzialità di differenziarsi in cellule appartenenti alla linea osteogenica, condrogenica, adipogenica e miocitica e tra le MSC somatiche presenti in differenti distretti anatomici dei tessuti adulti, le più studiate sono le cellule staminali mesenchimali stromali presenti nel midollo osseo. In letteratura, numerosi studi documentano la presenza di fonti alternative di cellule mesenchimali, sempre definite MSC e che sono presenti in altri tessuti, con analogie e differenze rispetto alle cellule mesenchimali da midollo osseo. Progenitori cellulari multipotenti, con fenotipo mesenchimale e potenzialità differenziativa, sono stati isolati da tessuto adiposo, cordone ombelicale, polpa dentale, liquido amniotico e tessuti placentari, e lavori recenti documentano la presenza di cellule staminali tra le cellule della granulosa (GC) presenti in follicoli ovarici sani. Già dai primi stadi dello sviluppo follicolare il liquido follicolare (FF) comincia ad accumularsi all’ interno dell’antro follicolare e durante la formazione dei follicoli secondari in particolare, le cellule follicolari più profonde cominciano a produrne piccole quantità. Questo fluido contiene una popolazione cellulare con caratteristiche di staminalità mesenchimale, come dimostrato in lavori basati sull’analisi biologica del contenuto di liquidi follicolari ovarici scartati di routine durante le normali procedure di prelievo di ovociti per la fecondazione medicalmente assistita. Lo scopo del mio lavoro di tesi sperimentale è stato definito dall’ipotesi di considerare queste cellule staminali mesenchimali presenti nel liquido follicolare ovarico come una fonte alternativa alle MSC da midollo osseo per eventuali applicazioni nel campo della ricerca biomedica. Pertanto, l’obiettivo sperimentale principale è stato quello di valutare il mantenimento delle caratteristiche di staminalità a passaggi successivi di coltura in adesione e dopo i processi di congelamento-scongelamento in azoto, prevedendo un pannello di esperimenti per analizzare attività proliferativa, vitalità cellulare, capacità di adesione, espressione dei markers di staminalità mesenchimale e potenzialità differenziativa, al fine di. caratterizzare ulteriormente questa popolazione FF-MSC finora studiata al momento dell’isolamento e al primo passaggio in adesione su differenti supporti.