Analisi della risposta al danno al DNA nei mutanti sog1 (suppressor of gamma ray) di Physcomitrella patens attraverso l'utilizzo della tecnica comet assay.

The plant genome is constantly exposed to endogenous and exogenous DNA damaging factors (free radicals, radiation, genotoxins). The DNA damage response (DDR), defined as the sum of all DNA damage sensing/signaling and repair pathways, plays a key role in preserving genome stability and thus plant survival under adverse environmental conditions. Depending on the level of genotoxic injury, the cell can trigger cell cycle checkpoints and repair or programmed cell death. Comet assay or Single Cell Gel Electrophoresis (SCGE) is a widely used tool that allows the quantitative and qualitative study of DNA damage in nuclei isolated from single cells, embedded in agarose and transferred on microscope slides. This approach is currently used to investigate the cell response to genotoxic agents as well as to several biotic and abiotic stresses that inevitably lead to oxidative DNA damage. In the present study, two Physcomitrella patens mutants carrying mutations within the PpSog1 gene encoding the SOG1 (SUPPRESSOR OF GAMMA RAY) transcription factor were investigated. The SOG1 protein, currently regarded as the functional homolog of the animal p53 protein, represents the master regulator of DDR in plants. In order to acquire information on the SOG1 function in DDR, both P. patens mutants and the wild type line were exposed to increasing concentrations of the genotoxic agents bleomycin (BLM) and methyl methanosulfonate (MMS). The profiles of DNA damage accumulation and associated DNA repair kinetics were monitored by means of comet assay performed under AN (alkaline-neutral) and NN (neutral-neutral) conditions, respectively. Both P. patens sog1 mutants revealed increased sensitivity to the genotoxic agents, compared to wild type line. Furthermore, the resulting DNA repair kinetics highlighted different temporal profiles between the two sog1 mutants. This is the first characterization so far carried out for the two PpSog1 mutants. The reported data are discussed in view of the current knowledge on DDR in plants.

Il genoma vegetale è costantemente esposto a fattori endogeni ed esogeni che danneggiano il DNA (radicali liberi, radiazioni, genotossine). La risposta al danno del DNA (DNA Damage Response, DDR), definito come la somma di tutte le vie di percezione/trasduzione e riparazione del danno al DNA, svolge un ruolo chiave nel mantenimento della stabilità del genoma e quindi nella sopravvivenza delle piante in condizioni ambientali avverse. A seconda del livello di danno genotossico, la cellula può attivare “checkpoints” di controllo del ciclo cellulare e la riparazione del DNA o la morte cellulare programmata. Il comet assay o single cell elettroforesis (SCGE) è uno strumento ampiamente utilizzato, che permette lo studio quantitativo e qualitativo dei danni al DNA nei nuclei isolati da singole cellule, incorporato in agarosio e trasferiti su vetrini da microscopio. Questo approccio è attualmente impiegato per studiare la risposta cellulare ad agenti genotossici e stress di tipo abiotici, che inevitabilmente portano a danno ossidativo. Nel presente studio, sono stati analizzati due mutanti di Physcomitrella patens che presentano mutazioni nel gene PpSog1 che codifica per il fattore di trascrizione SOG1 (SUPPRESSOR OF GAMMA RAY). La proteina SOG1, attualmente considerata l'omologo funzionale della proteina animale p53, rappresenta il principale regolatore della risposta al danno del DNA (DDR) nelle piante. Al fine di acquisire informazioni sulla funzione SOG1 nella risposta al danno del DNA (DDR), entrambi mutanti P. patens e la linea wild-type sono stati esposti a concentrazioni crescenti degli agenti genotossici bleomicina (BLM) e methanosulfonate metile (MMS). I profili di accumulo del danno al DNA e le corrispondenti cinetiche del riparo del DNA sono stati monitorati utilizzando i protocolli di comet assay nelle condizioni AN (alcalino-neutro) e NN (neutro-neutro), rispettivamente. Entrambi i mutanti sog1 di P. patens hanno rivelato un aumento nel grado di sensibilità agli agenti genotossici, rispetto alla linea wild type. Inoltre, le cinetiche di riparo del DNA evidenziano la presenza di profili temporali che differiscono tra i due mutanti sog1. Questa è la prima caratterizzazione effettuata ad oggi dei mutanti sog1 di P. patens. I dati riportati sono discussi alla luce delle conoscenze attuali sulla risposta al danno del DNA (DDR) nelle piante.