The uremic syndrome is a pathological condition characterized by a large number of compounds. Typically, these compounds are called “uremic retention solutes” or “uremic toxins”, each ones with different molecular weights and different chemical proprieties. Some of this compounds are lipophilic and bound to protein, while other can be water-soluble and not bound to protein. It is possible to underline that, in the protein-bound solutes, the indoxyl sulfate (IS) and the p-cresyl sulfate (p-CS) are the more important responsibles of the biochemicals alteration and functionality alteration of the uremic syndrome. IS and p-CS can be the key-factor to determine the risk of the chronic kidney disease (CKD). Both the sulfates are the end result of the protein metabolism. They sharing some characteristics, for instance the albumin binding site and a low hemodialytic clearance. They are small compounds binding with albumin (more than 90%) in a reversible way and in a constant balance with a free-fraction. The free-fraction is filtered by glomerulus. The bound fraction is secreted by tubular epithelial cells, a function not provided by hemodialysis. The hemodialysis clearance is limited by protein binding, indeed, only the free-fraction can diffuse across the dialyzer membrane. Since the dialytic clearance it’s lower than the renal clearance, in the patients in hemodialysis, it is possible to notice highs plasmatic levels of p-CS and IS. To this compounds (and to their free-fraction) is attribute the highest biological negative impact in the progression of the uremic cardiological disease and to the kidney damage. Some studies are been made to evaluate if the plasmatic levels of the p-CS-free and IS-free can be considered as a valid marker of increase or decrease of CKD as well as a marker of dialysis quality. In 2007, EUTox publish a systematic review that report an high variability of the hematic concentration of the solutes, not only in patients with CKD but as well in healthy patients. This inconsistency come to light the necessity to develop new specific, accurate and reliable analytics methods. Nowadays, the common methods to determine levels of IS and p-CS are based on HPLC (High Performance Liquid Chromatography) with fluorescence detector (HPLC/FLD). A recent study[34], show the bias between the HPLC and the gold standard methods (GC-MS and LC-MS). Based on this study, the tandem mass spectrometry (MS/MS) can be considered a good way to achieve an specific and accurate analytics method. The goal of this work is the comparing of the analytic performance of a HPLC/FLD system with respect to a UPLC/MS system to measure the plasmatic free-fraction of IS and p-CS. The results will be achieved with a develop of a robust, easy and rapid method adapt to the biochemical clinic lab routine.
La sindrome uremica è caratterizzata dalla ritenzione di un gran numero di composti, definiti soluti di ritenzione uremica o tossine uremiche, con differenti masse molecolari e proprietà chimiche. Alcuni di questi sono idrosolubili e non legati alle proteine, mentre altri sono parzialmente lipofili e legate alle proteine. Vi è una maggiore evidenza che i soluti di ritenzione uremica legati alle proteine indoxil solfato (IS) e p-cresil solfato (p-CS) siano responsabili delle alterazioni biochimiche e funzionali presenti nella sindrome uremica e potrebbero rappresentare il fattore chiave per spiegare i tassi di mortalità persistentemente elevati nella malattia renale cronica (CKD). Entrambi derivano dalla fermentazione proteica e condividono caratteristiche importanti, come il sito di legame all'albumina e la scarsa clearance dialitica. Sono piccoli composti legati per oltre il 90% all’albumina, in modo reversibile e in costante equilibrio con la frazione libera, che viene filtrata dal glomerulo. La frazione legata viene secreta dalle cellule epiteliali tubulari, una funzione non replicata dall'emodialisi. La clearance per emodialisi è limitata dal legame proteico, poiché solo il soluto libero e non legato può diffondere attraverso la membrana. Poiché la clearance dialitica è molto più bassa della clearance renale, i soluti uremici p-CS e IS si accumulano a livelli plasmatici relativamente alti nei pazienti in emodialisi e ad essi (in particolare alla loro frazione libera) viene attribuito il maggior impatto biologico negativo nella progressione della malattia cardiovascolare uremica e al danno renale. Studi multicentrici sono stati effettuati per valutare se la misura delle concentrazioni sieriche della frazione libera di IS e p-CS può essere considerato un marcatore valido di progressione o di rallentamento della CKD, in caso di riduzione, oltre che di qualità della dialisi. La revisione sistematica del 2007, effettuata dall’EUTox, ha segnalato una variabilità delle concentrazioni ematiche dei due soluti, inaspettatamente ampia, sia nei soggetti normali sia nei pazienti con sindrome uremica. La conseguente discrepanza e distorsione nell’interpretazione dell’attività biologica/tossica di p-CS e IS ha fatto emergere la necessità di sviluppare metodi analitici più affidabili e che possano rispondere a severi criteri di accuratezza e specificità. Attualmente, i metodi più diffusi per la determinazione di IS e p-CS sono basati sulla cromatografia ad alte prestazioni (HPLC) con rivelazione fluorimetrica (HPLC/FLD). I limiti attribuiti a questa metodica sono stati rilevati in uno studio recente (34) nel quale i risultati ottenuti sono stati confrontati con metodi di riferimento (GC-MS, LC-MS), evidenziando un importante sovrastima di risultati nei primi rispetto ai secondi. Date le sue caratteristiche di specificità e selettività, la spettrometria di massa tandem (MS/MS) rappresenta la tecnica analitica ideale per risolvere questi problemi. L’obiettivo di questo lavoro è di confrontare le prestazioni analitiche di un sistema HPLC/FLD con un sistema UPLC/MS per la determinazione della frazione libera plasmatica di IS e p-CS e di sviluppare un metodo robusto, semplice e rapido, adatto alla routine di un laboratorio di biochimica clinica.
MISURA DELLA FRAZIONE LIBERA PLASMATICA DEI SOLUTI UREMICI P-CRESIL SOLFATO E INDOXIL SOLFATO MEDIANTE HPLC/FLD E UPLC/MS
LACAVALLA, ROSA
2017/2018
Abstract
The uremic syndrome is a pathological condition characterized by a large number of compounds. Typically, these compounds are called “uremic retention solutes” or “uremic toxins”, each ones with different molecular weights and different chemical proprieties. Some of this compounds are lipophilic and bound to protein, while other can be water-soluble and not bound to protein. It is possible to underline that, in the protein-bound solutes, the indoxyl sulfate (IS) and the p-cresyl sulfate (p-CS) are the more important responsibles of the biochemicals alteration and functionality alteration of the uremic syndrome. IS and p-CS can be the key-factor to determine the risk of the chronic kidney disease (CKD). Both the sulfates are the end result of the protein metabolism. They sharing some characteristics, for instance the albumin binding site and a low hemodialytic clearance. They are small compounds binding with albumin (more than 90%) in a reversible way and in a constant balance with a free-fraction. The free-fraction is filtered by glomerulus. The bound fraction is secreted by tubular epithelial cells, a function not provided by hemodialysis. The hemodialysis clearance is limited by protein binding, indeed, only the free-fraction can diffuse across the dialyzer membrane. Since the dialytic clearance it’s lower than the renal clearance, in the patients in hemodialysis, it is possible to notice highs plasmatic levels of p-CS and IS. To this compounds (and to their free-fraction) is attribute the highest biological negative impact in the progression of the uremic cardiological disease and to the kidney damage. Some studies are been made to evaluate if the plasmatic levels of the p-CS-free and IS-free can be considered as a valid marker of increase or decrease of CKD as well as a marker of dialysis quality. In 2007, EUTox publish a systematic review that report an high variability of the hematic concentration of the solutes, not only in patients with CKD but as well in healthy patients. This inconsistency come to light the necessity to develop new specific, accurate and reliable analytics methods. Nowadays, the common methods to determine levels of IS and p-CS are based on HPLC (High Performance Liquid Chromatography) with fluorescence detector (HPLC/FLD). A recent study[34], show the bias between the HPLC and the gold standard methods (GC-MS and LC-MS). Based on this study, the tandem mass spectrometry (MS/MS) can be considered a good way to achieve an specific and accurate analytics method. The goal of this work is the comparing of the analytic performance of a HPLC/FLD system with respect to a UPLC/MS system to measure the plasmatic free-fraction of IS and p-CS. The results will be achieved with a develop of a robust, easy and rapid method adapt to the biochemical clinic lab routine.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/21445