Numb was initially identified as a cell fate determinant in Drosophila. Most recently, a tumor suppressor function of Numb was uncovered in different human cancers. In particular, in our lab, we demonstrated that Numb expression is reduced in approximately 20-30% of breast tumors due to excessive proteasomal degradation. This event is associated with adverse prognosis and aggressive tumor phenotypes. At the molecular level, the biological aggressiveness of Numb-deficient breast tumors can be attributed to the activation of the oncogene Notch, which is inhibited by Numb in physiological conditions, and with the reduction of the levels and the activity of the tumor suppressor p53. Indeed, we showed that Numb is able to stabilize the p53 protein by inhibiting the E3 ubiquitin ligase, Hdm2, which mediates the ubiquitination and degradation of p53. The rescue of Numb levels in human primary tumor cells or the inhibition of Notch or the restoration of p53 with pharmacological agents, leads to decreased cellular proliferation and tumor growth and represents a possible therapeutic strategy for Numb-deficient breast cancers. A recent study in our lab aimed at elucidating the Numb mechanism of action with respect to p53 regulation indicated that only two out of the four major Numb isoforms, Numb 1 and 2, are able to bind Hdm2 and to regulate p53 activity. We also observed a correlation between low transcript levels of these two Numb isoforms and adverse prognosis in some breast tumors, suggesting that deregulation of Numb gene splicing might be an alternative mechanism of Numb deregulation in breast cancer. Thus, a better understanding of the different functions of the Numb isoforms and how they are regulated could provide invaluable insights into the mechanisms of tumor progression linked to the functional loss of Numb. To this end, we have identified specific interactors of the single Numb isoforms by co-immunoprecipitation and mass spectrometry. In particular, we identified SNX9, known to be involved in endocytosis and cellular motility, as one of the best candidates for a specific interaction with Numb 1 and 2. Using a series of in vitro and in vivo assays, we validated the direct interaction terminal region of Numb, known as PTBi, and the “low complexity” region of SNX9. We further demonstrated that SNX9 is also able to bind to p53 and that the presence of SNX9 is required for an efficient binding between Numb and p53. Notably, silencing SNX9 in human breast cells deficient for Numb rescued p53 levels and activity. These results suggest an involvement of SNX9 in the regulation of the Numb/p53 pathway. We now aim to elucidate the precise role of SNX9 in this pathway, which should lead to a better understanding of the molecular alterations in Numb-deficient tumors and of possible strategies to rescue p53 function in these tumors.
Il gene Numb è stato inizialmente identificato come un determinante del destino cellulare in Drosophila. Più recentemente è emersa la sua funzione come soppressore tumorale in diversi tumori umani; in particolare nel nostro laboratorio è stato dimostrato come l’espressione della proteina Numb si riduca nel 20-30% circa dei tumori al seno a causa di eccessiva degradazione proteasomale. Tale evento è associato a prognosi avversa e tumori particolarmente aggressivi. A livello molecolare tale osservazione si spiega con la deregolazione della segnalazione da parte dell’oncogene Notch, di cui Numb è un inibitore, e nella riduzione dei livelli di espressione e di attività del soppressore tumorale p53. Infatti, come emerso da un nostro precedente studio, Numb è in grado di stabilizzare la proteina p53 inibendo l’attività di Hdm2, un’ubiquitina ligasi E3 che media l’ubiquitinazione e la conseguente degradazione di p53. Il ripristino dei livelli di Numb in cellule primarie tumorali umane, l’inibizione di Notch o il ripristino di p53, tramite trattamento farmacologico, diminuiscono la capacità proliferativa cellulare e la crescita tumorale, configurandosi come una possibile strategia terapeutica per i tumori Numb-difettivi. Un recente studio nel nostro laboratorio volto a chiarire il meccanismo di azione di Numb nella regolazione di p53 ha indicato come solo due delle quattro isoforme note di Numb, la 1 e la 2, siano in grado di legare Hdm2 e di regolare quindi l’attività di p53. I bassi livelli di trascritto di queste due isoforme di Numb osservati in alcuni tumori al seno correlano con prognosi avversa, indicando che la deregolazione dello “splicing” del gene Numb possa essere un meccanismo alternativo di deregolazione di Numb in tumore. Una migliore comprensione delle diverse funzioni e della regolazione delle isoforme di Numb contribuirebbe quindi a far luce sul meccanismo di progressione tumorale legato alla perdita funzionale di Numb. A tale scopo abbiamo identificato interattori specifici delle singole isoforme di Numb tramite esperimenti di co-immunoprecipitazione e spettrometria di massa. In particolare è emersa come uno dei principali candidati per un’interazione specifica con le isoforme 1 e 2 di Numb la proteina SNX9, nota soprattutto per il suo ruolo nell’endocitosi e nella motilità cellulare. In prima analisi è stata validata, in saggi in vivo e in vitro, l’interazione diretta di SNX9 con le isoforme 1 e 2 di Numb. Sono state quindi indentificate le regioni delle proteine coinvolte nel legame, la regione N-term di Numb, nota come PTBi e la regione ‘low complexity’ di SNX9. Abbiamo ulteriormente prodotto evidenze di come SNX9 sia in grado di interagire anche con la proteina p53 e come la presenza di SNX9 sia richiesta per un efficiente legame tra la proteina Numb e p53. Inoltre la perdita di SNX9, tramite silenziamento genico, in cellule umane di mammella, associata alla perdita di Numb, ripristina i livelli e l’attività di p53. Tali risultati indicano un possibile coinvolgimento di SNX9 nella regolazione del ‘pathway’ di Numb e p53. Elucidare il ruolo preciso di SNX9 in questo ‘pathway’ potrebbe portare ad una migliore comprensione delle alterazioni molecolari nei tumori Numb difettivi ed al futuro sviluppo di possibili strategie per ripristinare la funzione di p53 in tali tumori.
SNX9, un nuovo interattore di Numb coinvolto nel circuito dell’oncosoppressore p53
CACCIATORE, ROBERTA
2018/2019
Abstract
Numb was initially identified as a cell fate determinant in Drosophila. Most recently, a tumor suppressor function of Numb was uncovered in different human cancers. In particular, in our lab, we demonstrated that Numb expression is reduced in approximately 20-30% of breast tumors due to excessive proteasomal degradation. This event is associated with adverse prognosis and aggressive tumor phenotypes. At the molecular level, the biological aggressiveness of Numb-deficient breast tumors can be attributed to the activation of the oncogene Notch, which is inhibited by Numb in physiological conditions, and with the reduction of the levels and the activity of the tumor suppressor p53. Indeed, we showed that Numb is able to stabilize the p53 protein by inhibiting the E3 ubiquitin ligase, Hdm2, which mediates the ubiquitination and degradation of p53. The rescue of Numb levels in human primary tumor cells or the inhibition of Notch or the restoration of p53 with pharmacological agents, leads to decreased cellular proliferation and tumor growth and represents a possible therapeutic strategy for Numb-deficient breast cancers. A recent study in our lab aimed at elucidating the Numb mechanism of action with respect to p53 regulation indicated that only two out of the four major Numb isoforms, Numb 1 and 2, are able to bind Hdm2 and to regulate p53 activity. We also observed a correlation between low transcript levels of these two Numb isoforms and adverse prognosis in some breast tumors, suggesting that deregulation of Numb gene splicing might be an alternative mechanism of Numb deregulation in breast cancer. Thus, a better understanding of the different functions of the Numb isoforms and how they are regulated could provide invaluable insights into the mechanisms of tumor progression linked to the functional loss of Numb. To this end, we have identified specific interactors of the single Numb isoforms by co-immunoprecipitation and mass spectrometry. In particular, we identified SNX9, known to be involved in endocytosis and cellular motility, as one of the best candidates for a specific interaction with Numb 1 and 2. Using a series of in vitro and in vivo assays, we validated the direct interaction terminal region of Numb, known as PTBi, and the “low complexity” region of SNX9. We further demonstrated that SNX9 is also able to bind to p53 and that the presence of SNX9 is required for an efficient binding between Numb and p53. Notably, silencing SNX9 in human breast cells deficient for Numb rescued p53 levels and activity. These results suggest an involvement of SNX9 in the regulation of the Numb/p53 pathway. We now aim to elucidate the precise role of SNX9 in this pathway, which should lead to a better understanding of the molecular alterations in Numb-deficient tumors and of possible strategies to rescue p53 function in these tumors.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/21448