The mammalian ovary is a highly complex and dynamic organ that undergoes a continuous tissue remodelling, to date still poorly understood. It is during folliculogenesis that the oocyte, enclosed inside layers of follicle cells, acquires developmental competence by storing maternal effect factors required to initiate and complete preimplantation development. Unclear remains whether the acquisition of developmental competence is, inside the ovary, territorial or ubiquitous. The aim of my thesis project was to demonstrate the potential of combining the fluorescence property of the eosin dye, when used to stain thick histological sections, with confocal imaging to identify competent versus incompetent follicles. The novel approach that we set up allowed, on 20 to 50 µm-thick sections, the identification and mapping of all the follicle types, from the primordial T1 (15 µm in diameter) to the antral pre-ovulatory T8 (320 µm), and, also, of subcellular components, such as the membranes of both follicular and germ cells, the oocyte’s zona pellucida and nucleolus. A key feature of eosin is that it binds to carboxylic and phenolic groups, providing a map of the protein-rich regions, including heterochromatin. Based on the identification of different types of chromatin organization surrounding the nucleolus, we succeeded in classifying developmentally competent (those that present a heterochromatic ring around the nucleolus; surrounded nucleolus, SN) versus incompetent (lacking the heterochromatic ring around the nucleolus; not-surrounded nucleolus, NSN) oocytes. Using this approach, and based on these results, my future work will be the classification and mapping of all the developmentally competent/incompetent follicles present inside an entire ovary, with the overarching objective of reconstructing an in-silico three-dimensional (3D) functional map.
Analisi al microscopio confocale di sezioni istologiche di ovario di topo colorate con eosina: un nuovo approccio per lo studio della follicologenesi. L'ovario di mammifero è un organo altamente complesso e dinamico che subisce un continuo rimodellamento tissutale, ad oggi, ancora poco conosciuto. È durante la follicologenesi che l'oocita, racchiuso in strati di cellule follicolari, acquisisce la competenza allo sviluppo, immagazzinando quei maternal effect factors necessari per iniziare e completare lo sviluppo preimpianto. Non è ancora chiaro se, all'interno dell'ovario, l'acquisizione di questa competenza allo sviluppo sia territoriale o ubiquitaria. Lo scopo del mio progetto di tesi è stato quello di dimostrare come il combinare la proprietà fluorescente dell’eosina, quando utilizzata per colorare sezioni istologiche spesse, con l'imaging confocale sia un importante strumento per identificare i follicoli competenti e non competenti allo sviluppo. Il nuovo approccio messo a punto ha permesso, su sezioni spesse dai 20 ai 50 µm, di identificare e di mappare tutti i tipi di follicoli, dal primordiale T1 (15 µm di diametro) all’antrale pre-ovulatorio T8 (320 µm) e, anche, le principali componenti subcellulari, come le membrane delle cellule follicolari e germinali, la zona pellucida dell'oocita e il suo nucleolo. Una caratteristica chiave dell'eosina è che si lega ai gruppi carbossilici e fenolici dei residui amminoacidici, fornendo una mappa delle regioni ricche di proteine, compresa quella eterocromatica. Sulla base dell'identificazione dei diversi tipi di organizzazione della cromatina che circondano il nucleolo, siamo riusciti a classificare gli oociti competenti allo sviluppo (quelli che presentano un anello eterocromatico intorno al nucleolo; surrounded nucleolus, SN) rispetto agli incompetenti (privi dell'anello eterocromatico intorno al nucleolo; not-surrounded nucleolus, NSN). Utilizzando questo approccio, e sulla base dei risultati ottenuti, il mio lavoro futuro prevede la classificazione e la mappatura di tutti i follicoli competenti/incompetenti presenti all'interno di un intero ovario, con l'obiettivo a lungo termine di ricostruirne una mappa funzionale tridimensionale (3D) in silico.
Combining confocal imaging with eosin-stained mouse ovarian histological sections: a novel approach to study folliculogenesis
GOLLINI, ELENA
2020/2021
Abstract
The mammalian ovary is a highly complex and dynamic organ that undergoes a continuous tissue remodelling, to date still poorly understood. It is during folliculogenesis that the oocyte, enclosed inside layers of follicle cells, acquires developmental competence by storing maternal effect factors required to initiate and complete preimplantation development. Unclear remains whether the acquisition of developmental competence is, inside the ovary, territorial or ubiquitous. The aim of my thesis project was to demonstrate the potential of combining the fluorescence property of the eosin dye, when used to stain thick histological sections, with confocal imaging to identify competent versus incompetent follicles. The novel approach that we set up allowed, on 20 to 50 µm-thick sections, the identification and mapping of all the follicle types, from the primordial T1 (15 µm in diameter) to the antral pre-ovulatory T8 (320 µm), and, also, of subcellular components, such as the membranes of both follicular and germ cells, the oocyte’s zona pellucida and nucleolus. A key feature of eosin is that it binds to carboxylic and phenolic groups, providing a map of the protein-rich regions, including heterochromatin. Based on the identification of different types of chromatin organization surrounding the nucleolus, we succeeded in classifying developmentally competent (those that present a heterochromatic ring around the nucleolus; surrounded nucleolus, SN) versus incompetent (lacking the heterochromatic ring around the nucleolus; not-surrounded nucleolus, NSN) oocytes. Using this approach, and based on these results, my future work will be the classification and mapping of all the developmentally competent/incompetent follicles present inside an entire ovary, with the overarching objective of reconstructing an in-silico three-dimensional (3D) functional map.È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
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https://hdl.handle.net/20.500.14239/21586