STUDIO IMMUNOISTOCHIMICO DELLE ALTERAZIONI DELLA MATRICE EXTRACELLULARE DURANTE LO SVILUPPO POSTNATALE DEL CERVELLETTO IN TOPI CON DEFICIENZA DI PROLIDASI (PD)

Prolidase deficiency (PD) is a recessive autosomal disease caused by a mutation in the PEPD gene, with a frequency of 1-2 subject per 1 million people. Patients with PD show a variable phenotype with varying degrees of mental retardation. Still there is no functional correlation between brain deficits and PD. Prolidase is a matrix metalloproteinase family (MMP) member. MMPs, together with their inhibitors (metalloproteinase tissue inhibitors, TIMPs), regulate maturation and remodeling of the extracellular matrix (ECM) throughout the entire life cycle. Prolidase is able to cleave dipeptides when proline or hydroxyproline residues are the C-terminal residues. The prolidase activity has a considerable impact on the metabolism of many biologically important molecules, especially during collagen and procollagen biosynthesis and degradation. Therefore, prolidase has an indirect role in remodeling of the extracellular matrix. ECM adjustments are essential in the brain, expecially during the critical development period in which they play a pivotal role in proliferation, cell migration, differentiation, axonal guidance, synaptogenesis, myelinization, homeostatic plasticity, learning and memory processes and angiogenesis. The basal membrane beside the pial meninx (pBM) is a specialized ECM structure whose integrity and proper assembly are essential for proper cortical development. The ruptures in pBM, even if localized, are followed by changes in morphology in radial glia cells, subsequent cortical dysplasia, overmigration of neurons, decreased proliferation and migration of granule cell precursors, and reduction of Purkinje's neuronal dendrites. In literature, a mutant mouse has been identified as the perfect model to study the effects of the disease on the brain structures, the "dark like" (dal) mouse. The dal/dal phenotype includes small body size, reproductive degeneration, vacuolated cells at the corticomedullary junction of the adrenal gland, mild hydrocephalus, dark urine and altered bone phenotype. We performed fluorescence immunohistochemical investigations on mice of ages P10 and P60 with dal/+ and dal/dal genotypes. These analyses allowed us to study the phenotype at two different histogenetic and morphogenetic moments: a still developing brain and an already mature brain. The results obtained suggests that the absence of a fully functional prolidase enzyme in the mouse causes a pBM integrity damage with an altered collagen, laminin and reelin profile. In addition, a calcium protein, calbindine (CB), which is concentrated in the dendritic, the axons, and the soma of the Purkinje cells, was evaluated. Its expression grows with the advancement of the animal's age and during postnatal development there is an increase in the marking of CB positive neurons both for the cell body and dendrites projecting in the molecular layer of the Purkinje neurons. In our experiments a variability in CB deposition has been detected in dal-deficient mouses.

La deficienza di prolidasi (PD) è una patologia autosomica recessiva causata da una mutazione nel gene PEPD e presenta una frequenza di circa 1-2 casi su 1 milione di persone. I pazienti affetti da PD presentano un fenotipo variabile e diversi gradi di ritardo mentale. Ad oggi non esiste una correlazione funzionale tra deficit cerebrali e PD. La prolidasi è un membro della famiglia delle metalloproteinasi di matrice (MMP). Le MMPs, insieme ai loro inibitori (inibitori del tessuto delle metalloproteinasi, TIMPs), regolano la maturazione e il rimodellamento della matrice extracellulare per tutto il ciclo vitale. In particolare, la prolidasi è in grado di separare i dipeptidi quando residui di prolina o idrossiprolina sono localizzati all'estremità C terminale. La funzione dell’attività prolidasica risulta avere un impatto considerevole sul metabolismo di molte molecole biologicamente importanti, in particolare per la biosintesi e la degradazione del collagene e del procollagene; pertanto, la prolidasi ha un ruolo indiretto nel rimodellamento della matrice extracellulare (ECM). Le regolazioni dell’ECM sono essenziali nel cervello, specialmente durante il periodo critico dello sviluppo, esse hanno un ruolo essenziale nella proliferazione, migrazione cellulare, differenziamento, guida assonale, sinaptogenesi, mielinizzazione, sulla plasticità omeostatica, sui processi di apprendimento e memoria, sull'angiogenesi . La membrana basale accanto alla meninge piale (pBM) è una struttura specializzata dell’ECM la cui integrità e il corretto montaggio sono essenziali per un corretto sviluppo corticale, parallelamente il collagene IV svolge un ruolo cruciale nella stabilità pBM. Le rotture, anche localizzate, nel pBM sono accompagnate da cambiamenti nella morfologia delle cellule della glia radiale, con successiva displasia corticale, overmigrazione dei neuroni, diminuzione della proliferazione e migrazione dei precursori delle cellule di granuli e riduzione dei dendriti dei neuroni di Purkinje. Precedenti studi scientifici hanno identificato un modello murino esemplare per lo studio degli effetti della patologia sulle strutture cerebrali, il mutante “dark like” (dal). L’omozigosi della mutazione dal comporta piccole dimensioni corporee, degenerazione riproduttiva, cellule vacuolate alla giunzione midollare corticale della ghiandola surrenale, idrocefalia lieve, urina scura e fenotipo osseo alterato. Per il nostro studio abbiamo utilizzato tecniche di immunoistochimica in fluorescenza su topi dark like omo ed eterozigotici di età P10 e P60 (età postnatale del cervelletto dell’animale). L’utilizzo di due momenti istogenetici e morfogenetici diversi ha permesso l’analisi di un cervello in via di sviluppo in contrapposizione ad un cervello già maturo. I dati ottenuti suggeriscono che l'assenza di un enzima prolidasi completamente funzionante nel topo dal/dal provochi un danno dell'integrità del pBM con un conseguente profilo alterato di collagene, laminina e relina. In aggiunta all’analisi delle prolidasi, è stata qualitativamente valutata la presenza di una proteina legante il calcio, la calbindina (CB). In condizioni fisiologiche, CB si concentra nelle ramificazioni dendritiche, negli assoni e nel soma delle cellule del Purkinje. La sua espressione cresce con l’avanzare dell’età dell’animale; durante lo sviluppo postnatale si ha un incremento nella marcatura dei neuroni CB positivi sia nel corpo cellulare che nei dendriti proiettati nello strato molecolare dei neuroni del Purkinje. Grazie allo studio ivi eseguito, è stata individuata una variabilità nella deposizione della CB nei topi presentanti mutazione a carico del gene dal