Telomeres are nucleoprotein complexes located at the end of the linear chromosomes in Eukaryotes. They are constituted by short G-rich DNA tandem repeats; in particular the repeated unit in mammals is (TTAGGG). Telomeres are not recognized by the DNA repair machinery as double strand breaks because of the formation of a stable structure thanks to a specific DNA-protein interaction. The primary function of telomeres is to protect chromosome from recombination, exonuclease degradation and end to end fusion. In somatic cells telomere length shortens with age. Progressive shortening of telomeres leads to senescence, apoptosis, or oncogenic transformation. The situation is different in stem and germ cells, in which the specific reverse transcriptase called telomerase plays a key role in the maintenance of a stable telomere length by adding new telomeric repeats. It has been shown that telomerase is reactivated in the 90% of tumors and in immortalized cells. In 2007 it was discovered that telomeres are not transcriptionally silent (Azzalin et al., 2007); in fact they are transcribed in a long non-coding RNA named TERRA (TElomeric Repeats-containing RNA). TERRA is evolutionarily conserved and has been documented in mammals, yeasts, birds, plants and fish. TERRA is transcribed mainly by RNA polymerase II in a subtelomere-to-telomere direction; the functional promoter for telomere transcription is present in at least 20 subtelomeres and it contains three types of tandem repeats composed of 61 bp, 29 bp and 37 bp units. It has been proposed that TERRA covers several functions at telomeres, including recruitment of telomerase, inhibition of telomerase activity, assembly of DNA damage repair proteins and maintenance of telomeric heterochromatin although many results are still controversial. During my internship I analyzed the expression of TERRA by slot blot and, when it was possible, also by real time qPCR in healthy donors and in patients affected by myelofibrosis. I started to study the levels of TERRA in CD3+ and granulocytes from blood samples of 29 healthy donors. CD3+ are T lymphocytes expressing the CD3 proteins on their surface, that allows the activation of the cytotoxic T cells; granulocytes are a category of white blood cells characterized by the presence of granules in their cytoplasm. Samples were obtained from donors classified in two groups according to their age: 25-35 years and older than 50 years. Our results showed that, in both ranges, TERRA levels were higher in granulocytes than CD3+. I then analyzed the expression of TERRA in CD3+, granulocytes and CD34+ in patients affected by myelofibrosis. CD34+ are lymphocytes expressing the membrane protein CD34 and are normally found in the umbilical cord and bone marrow as hematopoietic cells. Circulating CD34+ cells are one of the markers of the myelofibrosis. Our results showed that TERRA levels in CD3+ cells in patients are significantly higher than in granulocytes, compared to healthy donors. The expression of TERRA in CD34+ is similar or higher than in CD3+. The data obtained by slot blot are validated by real time qPCR, although we observed interindividual variation. In conclusion, our results suggest that, in patients, telomere transcription is altered. These findings need a confirmation by performing analysis on a larger number of individuals because our data are based on a statistically limited number of samples. Azzalin, C.M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., and Lingner, J. (2007). Telomeric repeat– containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science 318, 798– 801.

I telomeri sono complessi nucleoproteici localizzati alle estremità lineari dei cromosomi eucariotici. Sono corte sequenze ripetute in tandem ricche in G; in particolare la sequenza ripetuta nei mammiferi è (TTAGGG). I telomeri non vengono riconosciuti dalla cellula come rotture a doppio filamento grazie alla formazione di strutture stabili dovute all’interazione di specifiche proteine con il DNA. La principale funzione del telomero è quella di proteggere i cromosomi dalla ricombinazione, dalla degradazione da parte di esonucleasi e dalla fusione tra estremità. Nelle cellule somatiche i telomeri si accorciano con l’età. Il progressivo accorciamento porta a senescenza, apoptosi o trasformazione tumorale. La situazione è invece diversa nelle cellule staminali e germinali dove una specifica trascrittasi inversa chiamata telomerasi svolge un ruolo importante nel mantenimento della lunghezza dei telomeri aggiungendo nuove ripetizioni telomeriche. È stato dimostrato che la telomerasi viene riattivata nel 90% dei tumori e nelle cellule immortalizzate. Nel 2007 nel nostro laboratorio è stato dimostrato che i telomeri vengono trascritti; infatti sono trascritti in una lunga molecola di RNA non codificante chiamata TERRA (TElomeric Repeats-containing RNA). TERRA è conservata ed è stata trovata nei mammiferi, negli uccelli, nel lievito, nelle piante e nei pesci. TERRA è trascritta principalmente dalla RNA polimerasi II in direzione subtelomero-telomero; il promotore è presente in almeno 20 subtelomeri e contiene tre tipi di tandem repeats formate da 61 bp, 29 bp e 37 bp. È stato proposto che TERRA copra diverse funzioni ai telomeri, tra cui il reclutamento della telomerasi, l’inibizione della telomerasi, il richiamo delle proteine coinvolte nella riparazione dei danni al DNA e mantenimento della eterocromatina al telomero sebbene molti risultati siano ancora controversi. Durante il mio internato di tesi ho analizzato l’espressione di TERRA mediante slot blot e, quando possibile, anche mediante real time qPCR in donatori sani e pazienti affetti da mielofibrosi. Ho iniziato a studiare i livelli di TERRA nelle cellule CD3+ e nei granulociti ottenuti da campioni di sangue di 29 donatori sani. I CD3+ sono linfociti T che esprimono, sulla membrane cellulare, la proteina CD3, la quale permette l’attivazione delle cellule T citotossiche; i granulociti sono una categoria di globuli bianchi caratterizzati dalla presenza di granuli nel loro citoplasma. I campioni sono stati ottenuti da donatori divisi in due fasce di età: 25-35 anni e più di 50 anni. I nostri risultati mostrano che, in entrambi i gruppi, i livelli di TERRA sono più alti nei granulociti che nei CD3+. Successivamente ho analizzato l’espressione di TERRA nei CD3+, nei granulociti e nei CD34+ di pazienti affetti da mielofibrosi. I CD34+ sono linfociti che esprimono la proteina di membrana CD34 e normalmente si trovano nel cordone ombelicale e nel midollo osseo come cellule emopoietiche. I CD3+ che circolano nel sangue sono uno dei marker per la mielofibrosi. I nostri risultati mostrano che i livelli di TERRA nei CD3+ e nei CD34+ dei pazienti sono più alti che nei granulociti. I dati ottenuti mediante slot blot sono stati validati, quando possibile, mediante real time qPCR, anche se si osserva variabilità da individuo a individuo. In conclusione i nostri risultati suggeriscono che, nei pazienti, la trascrizione dei telomeri è alterata. Queste osservazioni però richiedono una conferma analizzando un numero maggiore di campioni in quanto i nostri dati si basano su un numero statisticamente basso di campioni.

Telomeric RNA expression in blood cells from healthy donors and patients affected by myelofibrosis

TAVELLA, SARA
2015/2016

Abstract

Telomeres are nucleoprotein complexes located at the end of the linear chromosomes in Eukaryotes. They are constituted by short G-rich DNA tandem repeats; in particular the repeated unit in mammals is (TTAGGG). Telomeres are not recognized by the DNA repair machinery as double strand breaks because of the formation of a stable structure thanks to a specific DNA-protein interaction. The primary function of telomeres is to protect chromosome from recombination, exonuclease degradation and end to end fusion. In somatic cells telomere length shortens with age. Progressive shortening of telomeres leads to senescence, apoptosis, or oncogenic transformation. The situation is different in stem and germ cells, in which the specific reverse transcriptase called telomerase plays a key role in the maintenance of a stable telomere length by adding new telomeric repeats. It has been shown that telomerase is reactivated in the 90% of tumors and in immortalized cells. In 2007 it was discovered that telomeres are not transcriptionally silent (Azzalin et al., 2007); in fact they are transcribed in a long non-coding RNA named TERRA (TElomeric Repeats-containing RNA). TERRA is evolutionarily conserved and has been documented in mammals, yeasts, birds, plants and fish. TERRA is transcribed mainly by RNA polymerase II in a subtelomere-to-telomere direction; the functional promoter for telomere transcription is present in at least 20 subtelomeres and it contains three types of tandem repeats composed of 61 bp, 29 bp and 37 bp units. It has been proposed that TERRA covers several functions at telomeres, including recruitment of telomerase, inhibition of telomerase activity, assembly of DNA damage repair proteins and maintenance of telomeric heterochromatin although many results are still controversial. During my internship I analyzed the expression of TERRA by slot blot and, when it was possible, also by real time qPCR in healthy donors and in patients affected by myelofibrosis. I started to study the levels of TERRA in CD3+ and granulocytes from blood samples of 29 healthy donors. CD3+ are T lymphocytes expressing the CD3 proteins on their surface, that allows the activation of the cytotoxic T cells; granulocytes are a category of white blood cells characterized by the presence of granules in their cytoplasm. Samples were obtained from donors classified in two groups according to their age: 25-35 years and older than 50 years. Our results showed that, in both ranges, TERRA levels were higher in granulocytes than CD3+. I then analyzed the expression of TERRA in CD3+, granulocytes and CD34+ in patients affected by myelofibrosis. CD34+ are lymphocytes expressing the membrane protein CD34 and are normally found in the umbilical cord and bone marrow as hematopoietic cells. Circulating CD34+ cells are one of the markers of the myelofibrosis. Our results showed that TERRA levels in CD3+ cells in patients are significantly higher than in granulocytes, compared to healthy donors. The expression of TERRA in CD34+ is similar or higher than in CD3+. The data obtained by slot blot are validated by real time qPCR, although we observed interindividual variation. In conclusion, our results suggest that, in patients, telomere transcription is altered. These findings need a confirmation by performing analysis on a larger number of individuals because our data are based on a statistically limited number of samples. Azzalin, C.M., Reichenbach, P., Khoriauli, L., Giulotto, E., and Lingner, J. (2007). Telomeric repeat– containing RNA and RNA surveillance factors at mammalian chromosome ends. Science 318, 798– 801.
2015
Telomeric RNA expression in blood cells from healthy donors and patients affected by myelofibrosis
I telomeri sono complessi nucleoproteici localizzati alle estremità lineari dei cromosomi eucariotici. Sono corte sequenze ripetute in tandem ricche in G; in particolare la sequenza ripetuta nei mammiferi è (TTAGGG). I telomeri non vengono riconosciuti dalla cellula come rotture a doppio filamento grazie alla formazione di strutture stabili dovute all’interazione di specifiche proteine con il DNA. La principale funzione del telomero è quella di proteggere i cromosomi dalla ricombinazione, dalla degradazione da parte di esonucleasi e dalla fusione tra estremità. Nelle cellule somatiche i telomeri si accorciano con l’età. Il progressivo accorciamento porta a senescenza, apoptosi o trasformazione tumorale. La situazione è invece diversa nelle cellule staminali e germinali dove una specifica trascrittasi inversa chiamata telomerasi svolge un ruolo importante nel mantenimento della lunghezza dei telomeri aggiungendo nuove ripetizioni telomeriche. È stato dimostrato che la telomerasi viene riattivata nel 90% dei tumori e nelle cellule immortalizzate. Nel 2007 nel nostro laboratorio è stato dimostrato che i telomeri vengono trascritti; infatti sono trascritti in una lunga molecola di RNA non codificante chiamata TERRA (TElomeric Repeats-containing RNA). TERRA è conservata ed è stata trovata nei mammiferi, negli uccelli, nel lievito, nelle piante e nei pesci. TERRA è trascritta principalmente dalla RNA polimerasi II in direzione subtelomero-telomero; il promotore è presente in almeno 20 subtelomeri e contiene tre tipi di tandem repeats formate da 61 bp, 29 bp e 37 bp. È stato proposto che TERRA copra diverse funzioni ai telomeri, tra cui il reclutamento della telomerasi, l’inibizione della telomerasi, il richiamo delle proteine coinvolte nella riparazione dei danni al DNA e mantenimento della eterocromatina al telomero sebbene molti risultati siano ancora controversi. Durante il mio internato di tesi ho analizzato l’espressione di TERRA mediante slot blot e, quando possibile, anche mediante real time qPCR in donatori sani e pazienti affetti da mielofibrosi. Ho iniziato a studiare i livelli di TERRA nelle cellule CD3+ e nei granulociti ottenuti da campioni di sangue di 29 donatori sani. I CD3+ sono linfociti T che esprimono, sulla membrane cellulare, la proteina CD3, la quale permette l’attivazione delle cellule T citotossiche; i granulociti sono una categoria di globuli bianchi caratterizzati dalla presenza di granuli nel loro citoplasma. I campioni sono stati ottenuti da donatori divisi in due fasce di età: 25-35 anni e più di 50 anni. I nostri risultati mostrano che, in entrambi i gruppi, i livelli di TERRA sono più alti nei granulociti che nei CD3+. Successivamente ho analizzato l’espressione di TERRA nei CD3+, nei granulociti e nei CD34+ di pazienti affetti da mielofibrosi. I CD34+ sono linfociti che esprimono la proteina di membrana CD34 e normalmente si trovano nel cordone ombelicale e nel midollo osseo come cellule emopoietiche. I CD3+ che circolano nel sangue sono uno dei marker per la mielofibrosi. I nostri risultati mostrano che i livelli di TERRA nei CD3+ e nei CD34+ dei pazienti sono più alti che nei granulociti. I dati ottenuti mediante slot blot sono stati validati, quando possibile, mediante real time qPCR, anche se si osserva variabilità da individuo a individuo. In conclusione i nostri risultati suggeriscono che, nei pazienti, la trascrizione dei telomeri è alterata. Queste osservazioni però richiedono una conferma analizzando un numero maggiore di campioni in quanto i nostri dati si basano su un numero statisticamente basso di campioni.
File in questo prodotto:
Non ci sono file associati a questo prodotto.

È consentito all'utente scaricare e condividere i documenti disponibili a testo pieno in UNITESI UNIPV nel rispetto della licenza Creative Commons del tipo CC BY NC ND.
Per maggiori informazioni e per verifiche sull'eventuale disponibilità del file scrivere a: unitesi@unipv.it.

Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14239/21636